Μελέτη της επιδημιολογίας και της κλινικής σημασίας της λοίμωξης της γάτας από leishmania spp

Abstract

Feline infection by L. infantum has been reported in areas where canine leishmaniosis is endemic, including Mediterranean countries, Portugal, Brazil, and Iran. The epidemiologic importance of feline infection by the parasite remains obscure due to the relatively low number of properly designed epidemiological surveys, their conflicting results, and the limited body of scientific evidence on the propensity of infected cats to transmit L. infantum to sandflies. Based on current evidence, it seems that cats residing in endemic areas become more or less commonly infected by L. infantum, usually without presenting clinical signs or laboratory abnormalities, because of their innate resistance. However, a minority of the infected cats may present skin lesions (mainly ulcers and nodules), ocular and/or systemic signs (especially peripheral lymphadenomegaly, splenomegaly, hepatomegaly, and kidney disease) that can be accompanied by laboratory abnormalities, including anemia, hyperglobulinemia, azotemia, increased activity of ALP, ALT and AST, and proteinuria. In the context of epidemiological investigations, feline infection by L. infantum is usually diagnosed using molecular (PCR) and serological tests, whereas cytology, histopathology and culture can be additionally employed when there is suspicion of the disease. The aims of this study are to estimate the frequency of the infection in clinically healthy and sick cats, to identify the responsible Leishmania species, to investigate the parasitic load of infected cats, to explore the diagnostic sensitivity and specificity of cytology and serology (IFAT and ELISA), and to investigate possible associations between the infection and the signalment, living conditions, period of sampling, infection by other agents and presence of clinical signs or laboratory abnormalities. A total of 100 cats, older than 1 year, from Thessaly and Macedonia, Greece, were included and they were allocated into two groups: group A included 50 clinically healthy cats and group B included 50 cats with skin lesions, ocular and/or systemic signs. After history and physical examination, sampling of blood, urine, feces, rectal mucosa scrapes, lymph node aspirates, skin biopsies, bone marrow aspirates, and conjunctival smears was performed. Laboratory examinations included: a) PCR in blood, skin biopsies, bone marrow, and conjunctiva; b) identification of Leishmania species through nucleotide sequence analysis of PCR products; c) real-time PCR in conventional PCR-positive samples; d) cytology of buffy coat, rectal mucosal scrapes, lymph node aspiration smears, impression smears from skin biopsies, smears from the lesional skin of group B cats, bone marrow, and conjunctival smears; e) serology, including IFAT for IgG and IgM against Leishmania spp. and ELISA for IgG; f) hematology; g) serum biochemistry; h) urinalysis including urine protein/creatinine ratio; i) serology for FeLV, FIV, FCV, T. gondii and B. henselae, j) fecal parasitology; k) various additional diagnostic examination in group B cats in an effort to achieve, as precisely as possible, a definitive etiological diagnosis.Differences between group A and group B cats related to their signalment and living conditions included the older age (Ρ<0.001), less frequent outdoor lifestyle (Ρ<0,001) and common residency in urban areas (Ρ=0.019) of the latter. Skin lesions compatible with feline leishmaniosis were present in 18/50 (36%) group B cats, ocular signs in 1/50 (2%) and systemic signs in 28/20 (56%). Final diagnoses included 31 diseases but none of the cats was diagnosed with feline leishmaniosis. L. infantum was identified in all infected cats and PCR was positive in 41 of them, including 21/50 group A and 20/50 group B cats (Ρ=0.839). The results of PCR differed (Ρ=0.014) among the four types of samples (blood, skin biopsies, bone marrow, conjunctiva) being less frequently positive in the latter compared to the skin biopsies (Ρ=0.007) and bone marrow (Ρ=0.007). The possibility for positive PCR in one or more samples was higher (Ρ=0.046; OR: 0.44) when sampling had been performed during the period of sandfly activity, as well as, when group B cats presented at least one systemic sign compatible with feline leishmaniosis (Ρ=0.031; OR: 3.93). Parasitic density ranged from 28-238 parasites/ml (median: 87) in the blood, 29-325 (median: 96) in skin biopsies, 26-352 (median: 131) in bone marrow, and 198-283 (median: 241) in conjunctiva. Cytology was negative in all cats. Based on IFAT, IgG against Leishmania spp. were present in 10 cats (5 from group A and 5 from group B) and in one group A cat based on ELISA, whereas, IFAT for IgM was positive in one group A cat. The results of IFAT for IgG (Ρ<0,001), of ELISA (Ρ<0,001), and of IFAT for IgM (Ρ<0,001) were significantly different compared to PCR, mainly due to the low sensitivity of serology (0-14.3%). Furthermore, the results of IFAT for IgG were significantly different from the results of ELISA (Ρ=0.039) and were not associated with the signalment, living conditions, sampling period or clinical status of the study population. There was no important difference in the results of hematology and urinalysis between infected and non-infected cats, but an increased frequency of increased ALP activity (Ρ=0.032) and of increased total bilirubin (Ρ=0.032) and inorganic phosphorus (Ρ=0.03) was witnessed in the former cats.The results of serology for FeLV, FIV, FCV, T. gondii and B. henselae did not differ between group A and group B cats, between infected and non-infected cats, and between seropositive and seronegative cats. In conclusion, the results of this study show that: a) L. infantum is the only Leishmania species found to infect cats from Thessaly and Macedonia, Greece; b) the prevalence of the infection is considerable (41%) and does not differ between clinically healthy cats (42%) and cats with skin lesions, ocular signs and/or systemic sings (40%); c) multiple tissue examination with PCR is necessary to avoid underestimation of the prevalence of the infection; d) the diagnostic sensitivity of PCR differs among tissues and it is significantly lower for conjunctiva compared to skin biopsies and bone marrow; e) there is no factor relevant to the signalment and living conditions that influences the prevalence of the infection, but the latter is higher when sampling is performed during the period of sandfly activity; f) the prevalence of the infection does not differ between cats that are seropositive or seronegative for FeLV, FIV, FCV, T. gondii and B. henselae; g) all blood donor cats or the feline blood units should be examined with PCR to avoid the transmission of L. infantum through transfusions of blood; h) cytological examination of buffy coat, rectum smear, lymph node, skin, bone marrow and conjunctiva lacks sensitivity and is not recommended in the context of epidemiological investigations; i) IFAT and ELISA are characterized by high specificity but low sensitivity for the diagnosis of the infection which makes the results of seroepidemiological studies of questionable validity; j) the probability of positive IFAT for IgG is not associated with seropositivity to FeLV, FIV, FCV, T. gondii or B. henselae, k) the prevalence of the infection is higher in cats with at least one systemic sign compatible with feline leishmaniosis, in cats with increased ALP activity and in cats with increased total bilirubin or inorganic phosphorus serum concentrations.

Η μόλυνση της γάτας από τη L. infantum έχει διαπιστωθεί σε περιοχές όπου η λεϊσμανίωση του σκύλου που οφείλεται στο ίδιο πρωτόζωο είναι ενδημική και συγκεκριμένα στις μεσογειακές χώρες, την Πορτογαλία, τη Βραζιλία και το Ιράν. Η επιδημιολογική σημασία της μόλυνσης της γάτας παραμένει σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστη λόγω του σχετικά μικρού αριθμού κατάλληλα σχεδιασμένων μελετών, των αντιφατικών τους αποτελεσμάτων και των ελάχιστων ερευνητικών δεδομένων αναφορικά με την ικανότητα των μολυσμένων γατών να μεταδίδουν το πρωτόζωο στους φλεβοτόμους. Με τα μέχρι τώρα δεδομένα φαίνεται ότι οι γάτες που ζουν στις παραπάνω περιοχές μπορούν, περισσότερο ή λιγότερο συχνά, να μολυνθούν από τη L. infantum χωρίς συνήθως να εμφανίζουν συμπτώματα ή εργαστηριακά ευρήματα της νόσου, γεγονός που αποδίδεται στο γενετικό τους υπόστρωμα το οποίο ευνοεί την ανθεκτικότητα απέναντι στη νόσο. Σε ορισμένες όμως μολυσμένες γάτες μπορεί να διαπιστωθούν δερματικές αλλοιώσεις (συχνότερα έλκη και οζίδια), συμπτώματα από τους οφθαλμούς ή συμπτώματα ενδεικτικά της προσβολής των εσωτερικών οργάνων (ιδιαίτερα περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία, σπληνομεγαλία, ηπατομεγαλία και συμπτώματα λόγω νεφροπάθειας) που μπορεί να συνοδεύονται από παθολογικά ευρήματα από την αιματολογική (π.χ. αναιμία), τις βιοχημικές εξετάσεις (π.χ. υπερσφαιρινιαμία, αζωθαιμία, αυξημένη δραστηριότητα των ALP, ALT και AST) και την ανάλυση των ούρων (π.χ. πρωτεϊνουρία). Η διάγνωση της μόλυνσης από τη L. infantum στα πλαίσια επιδημιολογικών μελετών γίνεται συνήθως με μοριακές (PCR) και ορολογικές εξετάσεις, ενώ για τη διάγνωση της νόσου έχουν χρησιμοποιηθεί επιπλέον η κυτταρολογική, η ιστοπαθολογική εξέταση και η καλλιέργεια.Οι στόχοι της μελέτης αυτής ήταν η εκτίμηση της συχνότητας μόλυνσης των κλινικά υγιών και των ασθενών γατών μέσω της PCR σε τέσσερεις ιστούς, η ταυτοποίηση του υπεύθυνου είδους της Leishmania, η εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου, η εκτίμηση της διαγνωστικής ευαισθησίας και ειδικότητας των κυτταρολογικών εξετάσεων και δύο ορολογικών εξετάσεων (IFAT και ELISA) και η διερεύνηση τυχόν συσχετισμών μεταξύ της μόλυνσης και των στοιχείων ταυτότητας των γατών, των συνθηκών διαβίωσής τους, της περιόδου του έτους που εξετάστηκαν, της μόλυνσής τους από διάφορους άλλους λοιμογόνους παράγοντες και της παρουσίας συμπτωμάτων και παθολογικών ευρημάτων από την αιματολογική, τις βιοχημικές εξετάσεις και την ανάλυση των ούρων.Στη μελέτη περιλήφθηκαν 100 γάτες που ζούσαν στη Θεσσαλία και τη Μακεδονία και είχαν ηλικία τουλάχιστον 1 έτους και συγκεκριμένα 50 κλινικά υγιείς (ομάδα Α) και 50 γάτες με δερματικές αλλοιώσεις ή συμπτώματα από τους οφθαλμούς ή συμπτώματα ενδεικτικά της προσβολής των εσωτερικών οργάνων (ομάδα Β). Μετά τη λήψη του ιστορικού και την κλινική εξέταση λαμβάνονταν βιολογικά υλικά και συγκεκριμένα αίμα, ούρα, κόπρανα, υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του απευθυσμένου, υλικό παρακέντησης λεμφογαγγλίου, ιστοτεμάχια δέρματος, μυελός των οστών και υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του επιπεφυκότα. Οι εξετάσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν: α) η PCR στο αίμα, τα ιστοτεμάχια του δέρματος, το μυελό των οστών και το βλεννογόνο του επιπεφυκότα, β) η ταυτοποίηση του είδους της Leishmania μέσω της μέσω της in silico ανάλυσης ομολογίας της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του προϊόντος της PCR, γ) η real-time PCR στα δείγματα που ήταν θετικά με την PCR, δ) η κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από τη στοιβάδα λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη, το υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του απευθυσμένου, το υλικό παρακέντησης λεμφογαγγλίου, τα ιστοτεμάχια του δέρματος, τις δερματικές αλλοιώσεις των γατών της ομάδας Β, το μυελό των οστών και το υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του επιπεφυκότα, ε) η ορολογικές εξετάσεις IFAT (για IgG και IgM ανοσοσφαιρίνες έναντι της Leishmania spp.) και ELISA (για IgG ανοσοσφαιρίνες έναντι της Leishmania spp.), στ) η αιματολογική εξέταση, ζ) η πλήρης βιοχημική εξέταση στον ορό του αίματος, η) η ανάλυση των ούρων και η μέτρηση του λόγου πρωτεΐνες/κρεατινίνη, θ) οι ορολογικές εξετάσεις για FeLV, FIV, FCV, T. gondii και B. henselae, ι) η παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων, και ια) διάφορες άλλες εξετάσεις που ήταν απαραίτητες προκειμένου να επιτευχθεί η κατά το δυνατό ακριβέστερη αιτιολογική διάγνωση στις γάτες της ομάδας Β.Στις συγκρίσεις των στοιχείων ταυτότητας, των συνθηκών διαβίωσης και της περιόδου του έτους που εξετάστηκαν μεταξύ των γατών των ομάδων Α και Β έδειξε ότι οι τελευταίες είχαν μεγαλύτερη ηλικία (Ρ<0,001), ζούσαν λιγότερο συχνά σε εξωτερικούς χώρους (Ρ<0,001) και ζούσαν συχνότερα σε αστικές περιοχές (Ρ=0,019). Δερματικές αλλοιώσεις που έχουν αναφερθεί σε γάτες με λεϊσμανίωση διαπιστώθηκαν σε 18/50 (36%) γάτες της ομάδας Β, συμπτώματα από τους οφθαλμούς σε 1/50 (2%) και συμπτώματα ενδεικτικά προσβολής των εσωτερικών οργάνων σε 28/50 (56%). Στις τελικές διαγνώσεις των γατών αυτών περιλαμβάνονταν 31 νοσήματα ή παθολογικές καταστάσεις αλλά σε καμία γάτα δεν έγινε διάγνωση λεϊσμανίωσης. Η L. infantum ήταν το υπεύθυνο είδος και το DNA της απομονώθηκε από ένα ή περισσότερους ιστούς 41 γατών και συγκεκριμένα από 21/50 γάτες της ομάδας Α και 20/50 της ομάδας Β (Ρ=0,839). Το αποτέλεσμα της PCR διάφερε (Ρ=0,014) μεταξύ των τεσσάρων ιστών (αίμα, ιστοτεμάχια δέρματος, μυελός των οστών, υλικό απόξεσης επιπεφυκότα) και ήταν λιγότερο συχνά θετικό στο τελευταίο σε σύγκριση με τα ιστοτεμάχια του δέρματος (Ρ=0,007) και το μυελό των οστών (Ρ=0,007). Η πιθανότητα θετικού αποτελέσματος της PCR σε ένα ή περισσότερους ιστούς ήταν μεγαλύτερη (Ρ=0,046, OR: 0,44) όταν η δειγματοληψία γινόταν την περίοδο δραστηριότητας των φλεβοτόμων και προκειμένου για τις γάτες της ομάδας Β, όταν αυτές εμφάνιζαν ένα τουλάχιστον σύμπτωμα ενδεικτικό της προσβολής των εσωτερικών οργάνων που έχει συνδεθεί με τη λεϊσμανίωση της γάτας (Ρ=0,031, OR: 3,93). Το παρασιτικό φορτίο στο αίμα κυμαίνονταν από 28-238 παράσιτα/ml (διάμεσος: 87), στα ιστοτεμάχια του δέρματος από 29-325 (διάμεσος: 96), στο μυελό των οστών από 26-352 (διάμεσος: 131) και στο υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του επιπεφυκότα 198-283 (διάμεσος: 241). Οι κυτταρολογικές εξετάσεις ήταν αρνητικές σε όλες τις γάτες της μελέτης.IgG ανοσοσφαιρίνες έναντι της Leishmania spp. βρέθηκαν σε 10 γάτες (5 από την ομάδα Α και 5 από την ομάδα Β) με την IFAT και σε μια γάτα (από την ομάδα Α) με την ELISA, ενώ IgM ανοσοσφαιρίνες βρέθηκαν σε μια γάτα (από την ομάδα Α) με την IFAT. Τα αποτελέσματα της IFAT για IgG (Ρ<0,001), της ELISA (Ρ<0,001) και της IFAT για IgM (Ρ<0,001) διέφεραν από εκείνα της PCR κυρίως λόγω της πολύ μικρής τους ευαισθησίας (0-14,3%), ενώ τα αποτελέσματα της IFAT για IgG διάφεραν από εκείνα της ELISA (Ρ=0,039) και δε συνδέονταν με κανένα από τα στοιχεία ταυτότητας των γατών, της συνθήκες διαβίωσής τους, την περίοδο της δειγματοληψίας, την ομάδα τους ή την κλινική εικόνα των γατών της ομάδας Β.Δεν υπήρχε κάποια αξιόλογη διαφορά στα αποτελέσματα της αιματολογικής εξέτασης ή της ανάλυσης των ούρων μεταξύ των μολυσμένων από τη L. infantum και των μη μολυσμένων γατών, αλλά οι μολυσμένες γάτες της ομάδας Β είχαν συχνότερα αυξημένη δραστηριότητα ALP (Ρ=0,032) και αυξημένες συγκεντρώσεις ολικής χολερυθρίνης (Ρ=0,032) και ανόργανου φωσφόρου (Ρ=0,03) σε σύγκριση με τις μη μολυσμένες γάτες της ίδιας ομάδας.Τα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων για FeLV, FIV, FCV, T. gondii και B. henselae δε διέφεραν μεταξύ των γατών των ομάδων Α και Β, μεταξύ των μολυσμένων και των μη μολυσμένων γατών ή μεταξύ των ορολογικά θετικών και ορολογικά αρνητικών γατών.Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής προκύπτει ότι: α) η L. infantum είναι το μόνο είδος του γένους Leishmania που βρέθηκε στις μολυσμένες γάτες από τη Θεσσαλία και τη Μακεδονία, β) η συχνότητα μόλυνσης της γάτας από τη L. infantum είναι αρκετά μεγάλη (41%) και δε διαφέρει μεταξύ των κλινικά υγιών γατών (42%) και εκείνων που εμφανίζουν δερματικές αλλοιώσεις, συμπτώματα από τους οφθαλμούς ή συμπτώματα ενδεικτικά της προσβολής των εσωτερικών οργάνων (40%), γ) η εξέταση δειγμάτων από πολλαπλούς ιστούς με την PCR είναι απαραίτητη προκειμένου να μην υποεκτιμηθεί η συχνότητα μόλυνσης της γάτας από τη L. infantum, δ) η διαγνωστική ευαισθησία της PCR για την ανίχνευση του DNA της L. infantum στη γάτα διαφέρει μεταξύ των τεσσάρων ιστών που εξετάστηκαν και είναι σημαντικά μικρότερη στο υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του επιπεφυκότα σε σύγκριση με τα ιστοτεμάχια του δέρματος και το μυελό των οστών, ε) κανένας παράγοντας που να σχετίζεται με τα στοιχεία ταυτότητας των γατών και τις συνθήκες διαβίωσής τους δε συνδέεται με την πιθανότητα μόλυνσης από τη L. infantum αλλά η πιθανότητα αυτή είναι μεγαλύτερη όταν οι γάτες εξετάζονται την περίοδο δραστηριότητας των φλεβοτόμων, στ) η πιθανότητα μόλυνσης δε διαφέρει μεταξύ των γατών που είναι ορολογικά θετικές ή αρνητικές για FeLV, FIV, FCV, T. gondii και B. henselae, ζ) όλες οι γάτες αιμοδότες ή οι μονάδες αίματος γάτας που προορίζονται για μετάγγιση πρέπει να ελέγχονται με PCR για L. infantum προκειμένου να αποφευχθεί η μέσω των μεταγγίσεων μετάδοση του παρασίτου σε άλλες γάτες, η) η κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από τη στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη, το υλικό απόξεσης από το βλεννογόνου του απευθυσμένου, το υλικό παρακέντησης λεμφογαγγλίου, τα ιστοτεμάχια του δέρματος, τις δερματικές αλλοιώσεις, το μυελό των οστών και το υλικό απόξεσης από το βλεννογόνο του επιπεφυκότα δε συνιστάται για τον έλεγχο της συχνότητας μόλυνσης της γάτας από L. infantum λόγω της μικρής της ευαισθησίας, θ) οι ορολογικές εξετάσεις IFAT και ELISA για την ανίχνευση IgG ανοσοσφαιρινών έναντι της L. infantum χαρακτηρίζονται από πολύ μικρή ευαισθησία, γεγονός που δημιουργεί αμφιβολίες για την αξία των επιδημιολογικών μελετών που στηρίζονται στις εξετάσεις αυτές, ενώ αντίθετα, έχουν σχετικά μεγάλη ειδικότητα (ιδιαίτερα η ELISA), ι) η πιθανότητα θετικού αποτελέσματος της IFAT για την ανίχνευση IgG ανοσοσφαιρινών έναντι της L. infantum δεν εξαρτάται από την ταυτόχρονη μόλυνση από FeLV, FIV, FCV, T. gondii ή B. henselae, ια) η πιθανότητα μόλυνσης είναι μεγαλύτερη σε γάτες που εμφανίζουν ένα τουλάχιστον σύμπτωμα που είναι ενδεικτικό της προσβολής των εσωτερικών οργάνων και έχει συνδεθεί με τη λεϊσμανίωση της γάτας καθώς και στις ασθενείς γάτες που έχουν αυξημένη δραστηριότητας της ALP ή αυξημένης συγκέντρωση της ολικής χολερυθρίνης και του ανόργανου φωσφόρου.