Regulation of PTN expression by hypoxia and hypoxia-induced factors and possible functional significance

Abstract

Angiogenesis is a major aspect of tumor biology. Expanding tumors soon become hypoxic and demand new blood supply in order to support their rapid growth and to promote metastasis. Hypoxia and HIFs are the main factors involved in the expression of genes that turn on the 'angiogenic switch'. Among these, VEGF-A and its receptors, VEGFR1 and VEGFR2 are the most well known regulators of angiogenesis in both normoxic and hypoxic conditions. Our group has previously shown that VEGF165 binds to the receptor RPTPβ/ζ, leading to phosphorylation of the β3 subunit of integrin αvβ3 at Tyr773 and cell membrane localization of the multifunctional protein NCL. Cell surface NCL is glycosylated and mediates the stimulatory effect of several angiogenic factors, including VEGF and PTN. PTN is a heparin-binding growth factor that was initially found to promote neurite outgrowth in the rat brain during late development. PTN has been found to be over-expressed by many human malignancies and is involved in tumor angiogenesis. Despite its important biological actions, little is known on the regulation of PTN expression. Our group has previously shown that FGF-2, ROS and NO induce PTN expression and secretion through transcriptional activation of ptn promoter by AP-1. RPTPβ/ζ is the main receptor involved in PTN-induced migration of endothelial and cancer cells. Under some circumstances, PTN may also act as an angiostatic factor: PTN is found to directly interact with VEGF165 and inhibit its effect on endothelial cell proliferation and tube formation. In addition, PTN antisense expression increases angiogenesis both in vitro and in vivo. In the present study, we examined the effect of hypoxia and VEGF on PTN expression and function by human endothelial and cancer cells. We showed by using Western blot analyses, quantitative Real Time PCR and luciferase assays that acute and chemical hypoxia increase PTN expression and secretion through transcriptional activation of the corresponding gene. Using decoy oligonucleotide technology, we showed that in hypoxia, this effect is mediated by HIFs and partially through AP-1. The inductive effect of hypoxia on PTN secretion was not VEGF-mediated since VEGF decreased PTN secretion both in hypoxia and normoxia. Boyden assays in PTN knock-down cancer cells showed that PTN down-regulation enhances hypoxia-induced cell migration and RPTPβ/ζ is not involved in this effect. By using Western blot analyses, quantitative Real Time PCR and luciferase assays it was shown that VEGF decreased PTN expression and secretion through transcriptional inhibition of the corresponding gene. Treatment of cells with the monoclonal antibody bevacizumab showed that the receptor-binding domain of VEGF is not involved in its inhibitory effect on PTN expression and moreover, bevacizumab by itself may increase PTN secretion. HB-19 peptide that targets cell surface NCL inhibited VEGF effect on PTN secretion in human endothelial cells. However, HB-19 inhibited by itself both PTN secretion and ptn transcription and VEGF did not cause any further decrease in glioblastoma cells. VEGF-induced inhibition of PTN secretion depended on the presence or phosphorylation of the β3 subunit of integrin αvβ3 at Tyr773. The functional antibody LM-609 which does not inhibit cell surface localization of NCL failed to abolish the effect of VEGF on PTN secretion. Down-regulation of RPTPβ/ζ by siRNA which inhibits Tyr773 phosphorylation abolished the inhibitory effect of VEGF on PTN secretion. Collectively, these data suggest that RPTPβ/ζ-mediated ανβ3-induced cell surface NCL localization is involved in the inhibitory effect of VEGF on PTN secretion. In order to find the possible functional significance of these data, we tested the effect of PTN in VEGF-induced endothelial cell migration and found that it decreased migration to the levels of its own effect, while PTN112-136 completely abolished the stimulatory effect on cell migration. These data are in line with data from immunoprecipitation/Western blot analyses showing that VEGF binding to RPTPβ/ζ could be abolished by either PTN or PTN112-136. The migratory effect of VEGF could be also inhibited by HB-19 and CS-E, which could be explained by the fact that they also inhibit VEGF-NCL interaction, as is already known for HB-19 and shown in the present work by proximity ligation assays. Collectively, these data suggest that hypoxia increases whereas VEGF decreases PTN expression and secretion. In both cases, PTN seems to play an important role in limiting hypoxia and/or VEGF induced angiogenic activities, acting as an endogenous break of VEGF-induced aberrant angiogenesis. Mechanistically, the effect of hypoxia is both HIF- and AP-1-dependent and the effect of VEGF seems to be mediated by cell surface nucleolin and to require RPTPβ/ζ-mediated ανβ3 Tyr775 phosphorylation. PTN112-136, HB-19 and CS-E inhibit interaction of VEGF with RPTPβ/ζ or NCL and completely inhibit the migratory effect of VEGF on endothelial cells, suggesting that they could be further exploited as potential anti-angiogenic agents.

Η αγγειογένεση αποτελεί βασικό βήμα στην βιολογία του καρκίνου. Οι ταχέως αναπτυσσόμενοι όγκοι καθίστανται γρήγορα υποξικοί και ο σχηματισμός νέο-αγγείων είναι απαραίτητος για την εξάπλωση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Η υποξία και οι μεταγραφικοί παράγοντες HIF είναι παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που ενεργοποιούν τον ''αγγειογενετικό διακόπτη''. Από αυτά, ο VEGF-A και οι υποδοχείς του VEGF-R1 και VEGFR-2 είναι οι πιο γνωστοί επαγωγείς της αγγειογένεσης τόσο σε συνθήκες υποξίας όσο και σε νορμοξία. Η ερευνητική μας ομάδα έχει πρόσφατα δείξει σε μελέτη της ότι VEGF165 δεσμεύεται άμεσα στον υποδοχέα RPTPβ/ζ με αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 της ιντεγκρίνης αvβ3 στην τυροσίνη 773 και τον μεμβρανικό εντοπισμό της πολυ-λειτουργικής πρωτεΐνης NCL. Η μεμβρανική NCL είναι γλυκοζυλιωμένη και έχει βρεθεί ότι διαμεσολαβεί την αγγειογενετική δράση διαφόρων αυξητικών παραγόντων μεταξύ των οποίων ο VEGF και η PTN. Η PTN είναι ένας αυξητικός παράγοντας που παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια για την ηπαρίνη και είχε αρχικά ανακαλυφθεί στον εγκέφαλο αρουραίων ως παράγοντας που προάγει την ανάπτυξη των νευριτών κατά την διάρκεια της όψιμης εμβρυικής ανάπτυξης. Έκτοτε, η PTN έχει βρεθεί ότι υπέρ-εκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και εμπλέκεται στην αγγειογένεση των όγκων. Ωστόσο λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με την ρύθμιση της έκφρασης της. Η ερευνητική μας ομάδα σε προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι ο FGF-2, τα ROS και το NO επάγουν την έκφραση και έκκριση της PTN μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της από τον μεταγραφικό παράγοντα AP-1. Ο RPTPβ/ζ είναι ο κύριος υποδοχέας μέσω του οποίου έχει βρεθεί ότι η PTN επάγει την μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων. Υπάρχουν ωστόσο και κάποιες μελέτες που υποδεικνύουν ότι η PTN ασκεί και αντι-αγγειογενετικές δράσεις: η PTN δεσμεύεται άμεσα στον VEGF165 και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τον σχηματισμό αυλών από ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, αναστολή της έκφρασης της PTN επάγει την αγγειογένεση σε διάφορα μοντέλα in vitro και in vivo. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος της υποξίας και του VEGF στην έκφραση της PTN και της δράσης της τελευταίας σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα. Με την χρήση μεθόδων ανοσοαποτυπώματος, ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και την μέθοδο της λουσιφεράσης δείξαμε ότι η υποξία επάγει την έκφραση και έκκριση της PTN μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της. Σε πειράματα διαμόλυνσης με ολιγονουκλεοτίδια δολώματα φάνηκε ότι οι HIF και εν μέρει, ο AP-1 διαμεσολαβούν τις παραπάνω δράσεις της υποξίας. Ο VEGF δεν εμπλέκεται στις παραπάνω δράσεις της υποξίας αφού ανέστειλε την έκκριση της PTN τόσο σε υποξία όσο και σε νορμοξία. Σε πειράματα κυτταρικής μετανάστευσης σε γενετικά τροποποιημένα καρκινικά κύτταρα που δεν εκφράζουν PTN δείξαμε ότι η PTN αναστέλλει την επαγόμενη από υποξία μετανάστευση ανεξάρτητα από τον RPTPβ/ζ. Με την χρήση μεθόδων ανοσοαποτυπώματος, ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και την μέθοδο της λουσιφεράσης δείξαμε ο VEGF αναστέλλει την έκφραση και έκκριση της PTN λόγω αναστολής της μεταγραφής του γονιδίου της. Η περιοχή δέσμευσης του VEGF στους υποδοχείς του δεν εμπλέκεται στην παραπάνω δράση του όπως δείξαμε με προεπώαση των κυττάρων με το μονοκλωνικό αντίσωμα bevacizumab. Επιπρόσθετα, το bevacizumab είχε απο μόνο του επαγωγικό ρόλο στην έκφραση και έκκριση της PTN. Το πεπτίδιο HB-19 που στοχεύει την μεμβρανική NCL ανέστειλε τις παραπάνω δράσεις του VEGF σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εν αντιθέσει, το HB-19 ανέστειλε από μόνο του την έκκριση και μεταγραφή του γονιδίου της PTN σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος και ο εξωγενώς χορηγούμενος VEGF δεν είχε περεταίρω δράση. Με την χρήση γενετικά τροποποιημένων κυττάρων δείξαμε ότι η επαγόμενη από VEGF αναστολή της έκκρισης της PTN εξαρτάται από την παρουσία της β3 ή/και και την φωσφορυλίωση της στην τυροσίνη 773. Το λειτουργικό αντίσωμα LM-609, το οποίο δεν επηρεάζει τον μεμβρανικό εντοπισμό της NCL δεν ανέστειλε την επαγόμενη από VEGF αναστολή της έκκρισης της PTN. Ωστόσο, αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ με τεχνολογία siRNA που εμποδίζει την φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 ανέστειλε την παραπάνω δράση του VEGF. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι o RPTPβ/ζ διαμεσολαβεί την επαγόμενη από ανβ3 μεμβρανική εντόπιση της NCL η οποία εμπλέκεται στην ανασταλτική δράση του VEGF στην έκκριση της PTN. Σε πειράματα μετανάστευσης δείξαμε ότι η PTN αναστέλλει μερικώς την επαγόμενη από VEGF μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ το πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (PTN112-136) αναστέλλει πλήρως την επαγωγική δράση του VEGF. Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης/ ανοσοαποτυπώματος στα οποία δείξαμε ότι η δέσμευση του VEGF στον RPTPβ/ζ αναστέλλεται από την PTN ή την PTN112-136. Το HB-19 και οι ελεύθερες αλυσίδες CS-E ανέστειλαν επίσης την επαγόμενη από VEGF κυτταρική μετανάστευση. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί απο το γεγονός οτι το HB-19, αλλά και οι ελέυθερες αλυσίδες CS-E όπως προκύπτει με την μέθοδο του προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, αναστέλλουν την αλληλεπίδραση VEGF-NCL. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η υποξία επάγει, ενώ ο VEGF αναστέλλει την έκκριση και έκφραση της PTN. Η PTN παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της αγγειογέννεσης απο την υποξία ή/και τον VEGF, λειτουργώντας σαν ενδογενής ανασταλτικός παράγοντας στην υπερ-ενεργοποίηση της αγγειογένεσης από τον VEGF. Μηχανιστικά, η δράση της υποξίας φαίνεται να εξαρτάται από τον HIF και τον AP-1, ενώ τη δράση του VEGF διαμεσολαβεί η μεμβρανική εντόπιση της NCL που εξαρτάται από την επαγόμενη από τον RPTPβ/ζ φωσφορυλίωση της ιντεγκρίνης αvβ3 στην τυροσίνη 773. Η PTN112-136, το HB-19 και οι ελεύθερες αλυσίδες CS-E αναστέλλουν την αλληλεπίδραση του VEGF με τον RPTPβ/ζ ή την NCL και την επαγόμενη από VEGF κυτταρική μετανάστευση και χρήζουν περεταίρω διερεύνησης σαν πιθανοί αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες.