Η ανοσολογική απόκριση ολικού ανθρώπινου αίματος σε πρόκληση με στοιχεία του τοιχώματος μυκήτων

Abstract

Sepsis represents a major health problem, associated with highmortality and morbidity, prolonged length of stay at the hospital, andincreased direct and indirect costs. Especially in the Intensive Care Unit(ICU), sepsis is the leading cause of death. According to the findings of theSepsis Occurrence in Acutely Ill Patients (SOAP) study, 35% of critically illpatients develop sepsis at some point during their stay in the ICU, with lethalcomplications in 27% of them, a percentage that approaches 50% in patientswith septic shock. Gram-positive [gram (+)] bacteria have emerged as thecommonest cause of infections in the critically ill, followed by gram-negative[gram (-)] bacteria and by fungi, the latter of which are implicated inapproximately 18% of cases.Chronic Kidney Disease (CKD) is frequently complicated by infections,especially when it progresses to End-Stage Renal Disease (ESRD) thatrequires dialysis. The mortality of ESRD patients is approximately 20%, withcardiovascular disease and infections accounting for up to 70% of all deaths.The increased incidence of sepsis in ESRD patients is multifactorial, owing tothe uremic milieu, to malnutrition, and to dialysis procedure, that can affectmultiple sites of both the innate and the adaptive immunity. Hyperglycemia isa well-known factor that contributes to infectious complications. Alteredglucose homeostasis affects many aspects of immune response, includingsecretion of cytokines, function of immune cells and endothelial dysfunction.Patients with Diabetes Mellitus (DM) are actually extremely prone toinfections. Following a microbial insult the inflammatory response is initiated afterthe recognition of components of the microbial invader. The key proinflammatorycytokines are the tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and theInterleukins 6 (IL-6), 1β (IL-1β), and 8 (IL-8), which promote the inflammatoryreaction and the establishment of the Systemic Inflammatory ResponseSyndrome (SIRS). Along with the pro-inflammatory stimulation, the antiinflammatorystimulation is initiated, with its main representative, the IL-10.The predominance of the pro-inflammatory or the anti-inflammatory profile isassociated with both the clinical expression of the infection and the outcomeof sepsis.The pathogenesis of gram(-) sepsis has been studied extensively andis almost exclusively attributable to the lipopolysaccharide (endotoxin, LPS) ofbacterial cell wall. The fungus cell wall is consisted of three main groups ofpolysaccharides; polymers of mannose (mannoproteins, 40% of the cell walldry mass), polymers of glucose (b-glucan, 60% of the cell wall dry mass) andpolymers of N-acetylglucosamine (chitin, 2% of the cell wall dry mass).Among them mannan has special significance, since it provides antigenicvariability and possess immunostimulatory properties.Though convenient to think of a common pathogenic pathway as thebasis of all septic insults, there seems to be variation between differentbacterial species.Aim of the study: The main purpose of this study was to assess the basicimmune status of patients susceptible to fungal infections, and to evaluatetheir immunological reaction after stimulation with wall components of fungiand to compare their reaction with the corresponding of healthy adults, using an ex vivo model of stimulation. A secondary aim is to test whether thesegroups of patients are under immunoparalysis, a condition recognized inseriously ill patients with increasing frequency.Material and method: We measured serum cytokine levels as well ascytokine production after ex vivo mannan stimulation of whole blood takenfrom 10 healthy volunteers, 10 patients with ESRD, 10 patients with DM and10 patients on their 2nd day of stay in the ICU, who suffered non septic SIRSand had an APACHE II score ≥25. We used 100 μg/ml mannan for anincubation period of 8 h to stimulate 1 ml aliquots of whole blood. Bloodsamples were collected via a peripheral vein and the stimulation was takenplace under the same conditions for all the groups with mannam fromSaccharomyces cerevisiae from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA).Cytocines assay were determined using commercially available humanspecific ELISA kits.Results: All patient groups had higher baseline values of TNF-α, IL-6, IL-1β,and IL-10 compared to the control group, but only for the ICU patients thedifference was statistically significant. The ratio IL-10/IL-6 was found 0.33,0.22 and 0.96 for healthy persons, ESRD and DM patients, respectively, and1.32 for ICU patients prior to stimulation and 0.24, 0.35, 1.51, 1.17respectively after the stimulation. In all examined groups, the levels ofcytokines increased significantly after stimulation with mannan, although inseverely ill patients this change was considerably smaller. There was noevidence of immunoparalysis in all examined groups, regardless that therewas a relevant immunoparalysis in the diabetes mellitus and the ICU groupaccording to IL-10/Il-6 ratio. In addition, according to the IL-10/TNF-α ratio, all the patients groups had higher death probability in comparison with thehealthy volunteers, with the ICU group on top following from the diabetesmellitus group. The IL-10/TNF-α ratio before and after stimulation was0.52/0.35, 0.77/0.64, 0.96/0.91 and 1.46/1.19 for the healthy volunteers, theERSD, the DM and the ICU group respectively.Conclusions: The severely ill patients and secondarily the chronickidney disease patients and the patients with diabetes mellitus are in a proinflammatorystatus. The response of kidney disease patients and the patientswith diabetes mellitus in mannan stimulation was judged as satisfactory andcomparable to that of healthy individuals, while that of severe ill is differential,possibly due to their different immunological state. The ICU patients andsecondarily the DM patients had a relevant immunoparalysis.

Η σήψη αντιπροσωπεύει ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας, που σχετίζεταιμε υψηλή θνητότητα και θνησιμότητα, παρατεταμένη παραμονή για νοσηλείαστο Νοσοκομείο, και αυξημένα άμεσα και έμμεσα κόστη. Ειδικά στην ΜΕΘ, ησήψη είναι το πρώτο αίτιο θανάτου. Ακολούθως με τα αποτελέσματα τηςμελέτης Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients (SOAP), 35% των βαρέωςπασχόντων ασθενών αναπτύσσουν σήψη σε κάποιο σημείο της νοσηλείαςτους στην ΜΕΘ, με θανατηφόρες επιπλοκές στο 27% από αυτές, έναποσοστό που πλησιάζει το 50% σε ασθενείς με σηπτικό σοκ. Τα Grampositive[gram (+)] βακτήρια έχουν αναδειχθεί ως το συχνότερο αίτιο λοίμωξηςτων βαρέως πασχόντων ασθενών, ακολουθούμενα από τα gram-negative[gram (-)] βακτήρια και από τους μύκητες, οι οποίοι εμπλέκονται σε περίπου18% των περιπτώσεων.Η ΧΝΑ συχνά επιπλέκεται από λοιμώξεις, ειδικά όταν φτάνει στο τελικότης στάδιο που απαιτεί αιμοδιάλυση. Η θνητότητα των ασθενών με τελικούσταδίου ΧΝΑ είναι περίπου 20%, με τις καρδιαγγειακές παθήσεις και τιςλοιμώξεις να ενοχοποιούνται για το 70% των θανάτων. Η αυξημένη επίπτωσητης σήψης στους ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ είναι πολυπαραγοντική καιαποδίδεται στην ουραιμία, την υποθρεψία, και την διαδικασία αιμοδιάλυσης, ηοποία μπορεί να επηρεάσει πολλαπλώς τόσο την εγγενή όσο και την επίκτητηανοσία. Η υπεργλυκαιμία είναι ένας καλά μελετημένος παράγοντας πουευοδώνει σε λοιμώδεις επιπλοκές. Η διαταραγμένη ομοιόσταση της γλυκόζηςεπηρεάζει πολλές παραμέτρους της ανοσιακής απάντησης,συμπεριλαμβανομένης της εκκρίσεως κυτταροκινών, της λειτουργίας των κυττάρων της ανοσίας και της επιθηλιακής δυσπραγίας. Οι ασθενείς με ΣΔείναι συνήθως εξαιρετικά επιρρεπείς σε λοιμώξεις.Αμέσως μετά μια μικροβιακή προσβολή η φλεγμονώδης απάντησηξεκινάει μετά την αναγνώριση των συστατικών του μικροβιακού εισβολέα. Οικύριες προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες είναι ο TNF-α και οι ιντερλευκίνεςIL-6,IL-1β, and IL-8, οι οποίες προωθούν την φλεγμονώδη αντίδραση καιπροκαλούν την εμφάνιση του Συνδρόμου Συστηματικής ΦλεγμονώδουςΑντίδρασης {Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)}.Ταυτόχρονα με την προφλεγμονώδη διέγερση, ξεκινάει και ηαντιφλεγμονώδης, η οποία αντιπροσωπεύεται κυρίως από την IL-10. Ηκυριαρχία του προφλεγμονώδους ή του αντιφλεγμονώδους προφίλ σχετίζεταιμε την κλινική έκφραση της λοίμωξης και την έκβαση της σήψης αμφότερα.Η παθογένεση της gram(-) σήψης έχει μελετηθεί εκτεταμένως καιαποδίδεται σχεδόν αποκλειστικά στη δράση του λιποπολυσακχαρίτη(ενδοτοξίνη, LPS) του βακτηριακού τοιχώματος. Το κυτταρικό τοίχωμα τωνμυκήτων αποτελείται από τρείς κυρίως ομάδες πολυσακχαριδών, πολυμερήτης μανόζης (μαννοπρωτεΐνες, 40% της ξηρής μάζας του κυτταρικούτοιχώματος), πολυμερή της γλυκόζης (b-γλυκάνη, 60% της ξηρής μάζας τουκυτταρικού τοιχώματος) και πολυμερή της N-acetylglucosamine (χιτίνη, 2%της ξηρής μάζας του κυτταρικού τοιχώματος). Ανάμεσα σε αυτά οι μαννάνεςέχουν ιδιαίτερη σημαντικότητα, καθώς παρέχουν αντιγονική πολυμορφία καικατέχουν ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες.Παρότι είναι βολικό να πιστεύουμε ότι μια κοινή παθογενετική οδόςαποτελεί την βάση σε όλες τις σηπτικές προσβολές, φαίνεται να υπάρχειδιαφορετικότητα ανάμεσα σε διαφορετικά είδη βακτηρίων. Σκοπός της μελέτης: Ο κύριος σκοπός της παρούσης μελέτης είναι νααξιολογήσει την βασική ανοσιακή κατάσταση των ασθενών των ευπαθών σεμυκητιασικές λοιμώξεις, και να αξιολογήσει την ανοσολογική τους απάντησημετά διέγερση με συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων και νασυγκριθεί αυτή η αντίδραση με την αντίδραση υγειών εθελοντών ενηλίκων,χρησιμοποιώντας ένα ex vivo μοντέλο διέγερσης. Ένας δευτερεύων σκοπόςήταν να διαπιστωθεί το εάν αυτέ οι ομάδες ασθενών ευρίσκονται σεκατάσταση ανοσοπαράλυσης, κάτι που αναγνωρίζεται με ολοένα καιαυξανόμενη συχνότητα σε βαριά πάσχοντες ασθενείς.Υλικό και μέθοδος: Μετρήσαμε τα βασικά επίπεδα των κυτταροκινών τουορού καθώς και τα επίπεδα που παρήχθησαν αυτές μετά από ex vivoδιέγερση με μαννάνη σε ολικό αίμα που συνελέγη από 10 υγιείς εθελοντές, 10ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ, 10 ασθενείς με ΣΔ και 10 ασθενείς πουβρίσκονταν στη 2η ημέρα νοσηλείας τους σε ΜΕΘ, οι οποίοι είχαν μη σηπτικόSIRS και είχαν ένα APACHE II score ≥25. Χρησιμοποιήσαμε 100 μg/mlμαννάνης για μια περίοδο επώασης 8 ωρών ώστε να διεγείρουμε 1 ml ολικούαίματος. Τα δείγματα του αίματος συνελέγησαν από περιφερική φλέβα και ηδιέγερση έλαβε χώρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες για όλες τις ομάδες μεμαννάνη από Saccharomyces cerevisiae της εταιρείας Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA). Η μέτρηση των κυτταροκινών έγινε χρησιμοποιώνταςειδικά για το ανθρώπινο είδος εμπορικά διαθέσιμα κιτ με ELISA γιακυτταροκίνες.Αποτελέσματα: Όλες οι ομάδες των ασθενών είχαν υψηλότερες βασικέςτιμές TNF-α, IL-6, IL-1β, και IL-10 συγκρινόμενες με την ομάδα ελέγχου, αλλάμόνο στους ασθενείς της ΜΕΘ οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές. Ο λόγος IL-10/IL-6 βρέθηκε 0.33, 0.22 και 0.96 αντίστοιχα στους υγιείς, τουςασθενείς με ΧΝΑ και τους ασθενείς με ΣΔ, και 1.32 για τους ασθενείς τηςΜΕΘ πριν την διέγερση και 0.22, 0.51, 1.21, 2.46 αντίστοιχα μετά τηνδιέγερση. Σε όλες τις εξετασθείσες ομάδες, τα επίπεδα των κυτταροκινώναυξήθηκαν σημαντικά μετά την διέγερση με την μαννάνη, αν και οι βαριάπάσχοντες ασθενείς εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη μεταβολή. Δενδιαπιστώθηκε ανοσοπαράλυση σε όλες τις εξετασθείσες ομάδες, αν καιυπήρξε σχετική ανοσοπαράλυση στους ασθενείς με ΣΔ και στους ασθενείςτης ομάδας της ΜΕΘ σύμφωνα με τον λόγο IL-10/Il-6. Επιπλέον, σύμφωνα μετον λόγο IL-10/TNF-α, όλες οι ομάδες ασθενών έχουν υψηλότερη πιθανότηταθανάτου σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές, με αυτούς της ομάδας τηςΜΕΘ στην κορυφή της επικινδυνότητας και ακολουθούμενους από τουςασθενείς της ομάδας του ΣΔ. Ο λόγος IL-10/TNF-α πριν και μετά από τηνδιέγερση ήταν 0.52/0.35, 0.77/0.64, 0.96/0.91 και 1.46/1.19 για τους υγιείςεθελοντές, την ομάδα της ΧΝΑ, τους ασθενείς με ΣΔ και την ομάδα της ΜΕΘαντίστοιχα.Συμπεράσματα: Οι βαρέως πάσχοντες ασθενείς και δευτερευόντως οιασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΑ καθώς και οι ασθενείς με ΣΔ βρίσκονται σεπροφλεγμονώδη κατάσταση. Η ανταπόκριση των ασθενών με ΧΝΑ και ΣΔστην διέγερση με μαννάνη κρίνεται ως ικανοποιητική και συγκρίνεται με τηναντίδραση των υγειών ενηλίκων, ενώ αυτή των βαρέως πασχόντωνδιαφοροποιείται, πιθανά εξαιτίας της διαφορετικής ανοσολογικής τουςκατάστασης. Οι ασθενείς της ΜΕΘ και δευτερευόντως οι ασθενείς με ΣΔ είχανσχετική ανοσοπαράλυση.