Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων με τη χρήση νανοϋλικών και εφαρμογή τους στη βιοανάλυση

Abstract

During the recent years molecular genetics represent the new frontier. The geneticinformation required for the function and multiplication of the biological organism isstored, duplicated, and transformed by means of nucleic acids (NAs). So, because oftheir important role in life, nucleic acids (NAs) have been extensively studied with anumber of different techniques.Since Paleček discovered the electrochemical activity of NAs, a wide scaleresearch into electroche mistry of natural and chemically modified nucleic acids hasstarted. This research has led to a series of voltammetric approaches for rapid andinexpensive assays of DNA concentration and structure changes. So electrochemicalbiosensors have received enormous attention as they combine the analytical power ofelectrochemical methods with the specificity of NAs recognition processTo improve the sensitivity of DNA biosensor, nanomaterials, such as carbonnanotubes (CNTs), were used combined with electrochemical methods.Since their discovery in 1991 by Iijima, carbon nanotubes (CNTs) havebecome the subject of intense investigation. CNTs have attracted much attention asanalytical tools for a wide range of applications, due to their special chemical,electrical and mechanical properties. Considering the advantages of both singlewalled(SW) and multi-walled (MW) CNTs, such as high surface area, goodconductivity, favorable electronic properties and electrocatalytic effect, they presentan impressive success for the construction of electrochemical sensors and biosensors.In the beggining, the overall performance of three types of multi-walledcarbon nanotubes paste electrodes (MWNTPEs) was studied and discussed in terms ofoptimal analytical conditions, such as the electrochemical pretreatment and theaccumulation conditions of the dsDNA on the MWNTPEs. The results indicated thatthe electroactivity, inherent to carbon nanotubes paste electrodes, allowed a largeenhancement of the guanine oxidation signal compared to that obtained at theconventional carbon paste electrodes (CPEs), moreover, the extent of the enhancement depends on the type of MWNTs, incorporated into the paste. Also, usingadsorptive transfer stripping voltammetry (AdSTV), the studied carbon nanotubespaste electrodes (CNTPEs have been shown to be very suitable for the determinationof the calf thymus dsDNA. Based on the signal of guanine, under the optimalconditions, very low levels of dsDNA can be detected following short accumulationtimes for all the types of MWNTPEs (MWNTPE 1, MWNTPE 2, MWNTPE 3), withdetection limits of 2.64 mg L-1, 2.02 mg L-1 and 1.46 mg L-1, respectively.Additionally, the dsDNA isolated from rat liver tissues is determined by use of thepreviously mentioned MWNTPEs.As several efforts have been made in nucleic acids’ (NAs) electroanalysis toreplace the classical hanging mercury drop electrode (HMDE) or dropping mercuryelectrode (DME) by electrodes retaining electrochemical properties of the mercurysurface but possessing advantages of solid electrodes (non-toxic material, mechanicalresistance, applicability in simple and cheap sensor devices, etc.), the next step of thisstudy was the fabrication of a new electrode by plating a mercury film on a glassycarbon electrode previously modified with multi walled carbon nanotubes (MF /MWNTs / GCE).The MF / MWNTs / GCE was used for the analysis of single (ss) and doublestranded (ds) DNA, as well as for Jurkat genomic DNAs methylated to differentdegree. The results indicated that the DNA molecules adsorbed quite strongly at theMF / MWNTs / GCE surface allowing the ex situ adsorption and produce welldeveloped peaks (due to cytocine and adenine)) by using adsorptive stripping (AdS,ex situ) square wave voltammetry (SWV). Also, SWV of Jurkat DNA mixturesmethylated to different degrees revealed a linear decrease of the peak height withincreasing methylation indicating an increase of structural rigidity.Ionic liquids (ILs), which are ionic compounds composed of organic cationsand various anions, exhibit many virtues such as high chemical and thermal stability,negligible vapor pressure, high conductivity and solubility and wide potentialwindows which make them to hold a great promise in many studies ofelectrochemistry and electrochemical sensors.Due to these specific characteristics, ILs can be used as electrolytes, modifieron chemically modified electrode and can be mixed with graphite powder to obtain anew kind of chemically modified carbon paste electrode denoted as carbon ionicliquid electrode (CILE), which exhibits higher performance than the traditional working electrodes. Thus CILE has been used for the detection of differentelectroactive molecules or as a basal electrode for further modification. Also, CILEshave begun to be used in the field of nucleic acids (NAs) electrochemistry withimpressive success.Thus, later to the study, combining the ability of CNTs to promote theadsorption and the electron–transfer reactions with the attractive remarks of the ILs, apaste electrode based on carbon nanotubes and room temperature ionic liquid hasbeen prepared using MWNTs mixed with 1-Butyl-4-methylpyridiniumhexafluorophosphate (IL-CNTPE) and used for the study of dsDNA. Electrochemicalbehavior of dsDNA on the IL-CNTPE was carefully investigated with theelectrochemical parametres calculated. The prepared electrode showed the ability ofionic conductivity due the presence of IL layer on the CNTPE surface. DsDNA can beadsorbed on the electrode surface and an enhanced electrochemical oxidation with theincrease of peak current was exhibited. Based on the oxidation peak of guanine, underthe optimal conditions, very low levels of dsDNA can be detected following shortaccumulation time with detection limit of 0.249 mg L-1 by differential pulsevoltammetry (DPV).Interactions between DNA and surfactants have been studied extensively inrecent years. Recently a number of papers published in the literature on the subject ofDNA binding with surfactants, showing that DNA can form tight complexes withsurfactants, through hydrophobic or electrostatic binding.So, by exploiting this strong interaction, lately in our work, a CPE modifiedwith MWNTs has been used as the platform for further modification with surfaceconfinedfilms associated with cationic surfactants, such asdodecyltrimethylammonium bromide (DTAB) and tetradecyltrimethylammoniumbromide (TTAB). These novel electrodes (DTAB/MWNTs/CPE andTTAB/MWNTs/CPE) have been applied for the determination of dsDNA with muchsuccess. A comparison of the electrochemical performance between these electrodesand the bare MWNTs/CPE showed the imperative electrochemical behavior of thedsDNA at the DTAB/MWNTs/CPE and TTAB/MWNTs/CPE with respect to thelimit of detection and quantification. According to the results, an appropriate amountof the cationic surfactants can prompt the assembly of dsDNA on the MWNTs/CPEsurface. The ability of the DTAB and TTAB to bind to polyelectrolyte chains bearing electrical charges of opposite sign contributed to the enhanced adsorption of dsDNAon the electrode surface and led to improved sensitivity.In conclusion, the above results suggest that the new fabricated dsDNAmodified electrodes are a promising platform for the development of electrochemicalbiosensors with various applications, including direct quantification of DNA samples,for use in sequencing or polymerase chain reactions, or pharmaceutical testing,environmental and quality control, avoiding the high cost, time-consumption, lowsensitivity and procedural complication.

Τα νουκλεϊκά οξέα (ΝΑς), είναι τα µόρια –φορείς της γενετικής πληροφορίας ενόςκυττάρου. Στα µόρια των DNA βρίσκονται κωδικοποιηµένες όλες οι πληροφορίες, οιοποίες προσδιορίζουν τη φύση του κυττάρου, ελέγχουν την ανάπτυξη και τη διαίρεσητου. Λόγω, λοιπόν, του τόσο σηµαντικού τους ρόλου έχουν µελετηθεί εκτενώς µε έναπλήθος διαφορετικών τεχνικών.Από τη στιγµή που ο Paleček ανακάλυψε την ηλεκτροδραστικότητα τωννουκλεϊκών οξέων (ΝΑς), ξεκίνησε µια εκτενής έρευνα της ηλεκτροχηµείας τωνφυσικών και χηµικώς τροποποιηµένων νουκλεϊκών οξέων (ΝΑς). Η έρευνα αυτήοδήγησε σε µια σειρά από βολταµµετρικές προσεγγίσεις, τόσο για το γρήγορο καιανέξοδο ποσοτικό προσδιορισµό του DNA, όσο και για την ανίχνευση των αλλαγώνστη δοµή του. Έτσι οι ηλεκτροχηµικοί βιοαισθητήρες συγκέντρωσαν τεράστιαπροσοχή, καθώς συνδυάζουν τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των ηλεκτροχηµικώνµεθόδων, µε την ικανότητα αναγνώρισης των αλληλουχιών του DNA.Για τη βελτίωση της ευαισθησίας των ηλεκτροχηµικών βιοαισθητήρων DNAέχουν χρησιµοποιηθεί διάφορα νανοϋλικά, όπως οι νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs).Από την ανακάλυψή τους το 1991 από τον Iijima, οι νανοσωλήνες άνθρακα(CNTs) αποτέλεσαν αντικείµενο έντονης έρευνας και προσέλκυσαν µεγάλη προσοχήως αναλυτικά εργαλεία, για ένα ευρύ φάσµα εφαρµογών, λόγω των ιδιαίτερωνχηµικών, ηλεκτρικών και µηχανικών ιδιοτήτων τους. Λαµβάνοντας υπόψη ταπλεονεκτήµατα και των δύο τύπων νανοσωλήνων άνθρακα (CNTs), όπως η µεγάληεπιφάνεια, η καλή αγωγιµότητα και η εξαιρετική βιοσυµβατότητα, γίνεται φανερό ότιπροσφέρουν ένα περιβάλλον, το οποίο είναι κατάλληλο για την ακινητοποίησηβιολογικών συστατικών, ενώ επιπλέον ο υψηλός λόγος της επιφάνειας προς τον όγκοσυνεπάγεται και την αυξηµένη συσσώρευση των βιοµορίων. Γι΄ αυτό,χρησιµοποιούνται ευρέως στην κατασκευή αισθητήρων και βιοαισθητήρων.Αρχικά, κατασκευάστηκαν τρία ηλεκτρόδια πάστας νανοσωλήνων άνθρακα(MWNTPEs), χρησιµοποιώντας τρεις διαφορετικούς τύπους νανοσωλήνων άνθρακαπολλαπλών τοιχωµάτων (MWNTs), αντίστοιχα, οι οποίοι διέφεραν ως προς τις διαστάσεις τους. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, οι νανοσωλήνες άνθρακα σεσυνδυασµό µε την προσροφητική αναδιαλυτική βολταµµετρία αλλαγής µέσου(ΑdSTV) είναι κατάλληλοι για τον προσδιορισµό του dsDNA. ∆ιαπιστώθηκε αύξησητου σήµατος οξείδωσης της γουανίνης σε σύγκριση µε εκείνο που λαµβάνεται µε τασυµβατικά ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα (CPEs). Μεταξύ των τριών ηλεκτροδίωνMWNTPEs, το ηλεκτρόδιο MWNTPE3 παρουσίασε την καλύτερη ηλεκτροχηµικήσυµπεριφορά, λόγω της καταλληλότερης δοµής και µεγέθους των πόρων. Με βάση τοσήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενες αναλυτικές συνθήκες, πολύχαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούν µετά από σύντοµους χρόνουςακινητοποίησης και µε τα τρία ηλεκτρόδια MWNTPEs (MWNTPE1, MWNTPE2,MWNTPE3) µε όρια ανίχνευσης ίσα µε 2,64 mg L-1, 2,02 mg L-1και 1,46 mg L-1,αντίστοιχα.Καθώς πολλές προσπάθειες έχουν πραγµατοποιηθεί στον τοµέα τηςηλεκτροανάλυσης των νουκλεϊκών οξέων (ΝΑς) µε σκοπό την αντικατάσταση τωνυγρών ηλεκτροδίων υδραργύρου (ηλεκτρόδιο κρεµάµενης σταγόνας υδραργύρου(HMDE) και σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (DME)) µε ηλεκτρόδια, τα οποίαδιατηρούν τις ηλεκτροχηµικές ιδιότητες της επιφάνειας του υδραργύρου, αλλάταυτόχρονα διαθέτουν και τα πλεονεκτήµατα των στερεών ηλεκτροδίων (µη τοξικόυλικό, µηχανική αντοχή, εφαρµοσιµότητα σε απλές και φθηνές συσκευέςαισθητήρων, κ.λπ.), το επόµενο βήµα περιελάµβανε την κατασκευή ενός ηλεκτροδίουµε εναπόθεση υµενίου υδραργύρου σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα,τροποποιηµένου µε νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλών τοιχωµάτων (MF / MWNTs /GCE).Το MF / MWNTs / GCE χρησιµοποιήθηκε για την ανάλυση µονόκλωνου (ss)και δίκλωνου (ds) DNA, καθώς και για την ανάλυση ενζυµικά µεθυλιωµένου JurkatDΝΑ σε διαφορετικούς βαθµούς. Σύµφωνα µε τα πειραµατικά αποτελέσµατα και µεβάση τη µέγιστη µείωση της καθοδικής κορυφής της κυτοσίνης και της αδενίνης (CAκορυφή), η οποία δείχνει υψηλή ευαισθησία στη δοµή του DNA, εφόσον οιαναγόµενες περιοχές στην αδενίνη και την κυτοσίνη αποτελούν τµήµα των δεσµώνυδρογόνου και κρύβονται στο εσωτερικό της διπλής έλικας του µοντέλου WatsonCrick,το ηλεκτρόδιο MF / MWNTs / GCE µπορεί να ανιχνεύσει χαµηλά επίπεδα τωνµορίων του DNA, έπειτα από την ex situ προσρόφηση του, µε τη βοήθεια τηςπροσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίας (AdS) τετραγωνικού παλµού (SWV).Επίσης, τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το ηλεκτρόδιο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη διάκριση του δίκλωνου (ds) από το µονόκλωνο (ss) DNA και για την ανίχνευσηµεταβολών που προκύπτουν από την παρουσία µεθυλίωσης σε ένα µόριο DNA.Tα ιοντικά υγρά (ionic liquids, ILs), των οποίων η δοµή συνήθωςπεριλαµβάνει ένα µεγάλο οργανικό κατιόν και ένα µικρό ανόργανο ανιόν,παρουσιάζουν πολλά ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, όπως το µεγάλο ηλεκτροχηµικόπαράθυρο, την ικανότητα να προάγουν την µεταφορά ηλεκτρονίων, την υψηλήχηµική και θερµική σταθερότητα, τη σχετικά υψηλή αγωγιµότητα και την πολύ καλήβιοσυµβατότητα, µε αποτέλεσµα να βρίσκουν πολλές εφαρµογές στην ηλεκτροχηµείακαι στους ηλεκτροχηµικούς αισθητήρες.Λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους, τα ILs µπορούν ναχρησιµοποιηθούν είτε ως ηλεκτρολύτες είτε ως υλικό µορφοποίηησης ηλεκτροδίωνόπου η ανάµιξή τους µε σκόνη άνθρακα (συνήθως γραφίτη) οδηγεί σε ένα νέο είδοςχηµικώς τροποποιηµένων ηλεκτροδίων πάστας άνθρακα, που ονοµάζονταιηλεκτρόδια πάστας άνθρακα ιοντικού υγρού (carbon paste ionic liquid, CILE) και ταοποία παρουσιάζουν σηµαντικά µεγαλύτερη απόδοση από τα συµβατικά ηλεκτρόδιαεργασίας.Τα ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα ιοντικού υγρού (CILEs) χρησιµοποιούνταιγια την ανίχνευση διαφόρων ηλεκτροενεργών και µη ενώσεων είτε αυτούσια είτε ωςβάση για περαιτέρω µορφοποίηση. Πρόσφατα, τα ηλεκτρόδια πάστας ιοντικού υγρούCILEs, άρχισαν να χρησιµοποιούνται µε επιτυχία στο πεδίο της ηλεκτροχηµείας τωννουκλεϊκών οξέων (ΝΑς).Έτσι, στη συνέχεια της εργασίας, κατασκευάστηκε ένα ηλεκτρόδιο πάσταςνανοσωλήνων άνθρακα µε τη χρήση του 1-βουτυλο-4-µεθυλοπυριδινικούεξαφθοροφωσφορικού ιοντικού υγρού, ως συνδετικού µέσου (IL-CNTPE). Με τηχρήση του ηλεκτροδίου αυτού επιτεύχθηκε άµεση ηλεκτροχηµική µελέτη τουdsDNA. Συγκεκριµένα, έπειτα από ακινητοποίηση του dsDNA στην επιφάνεια τουηλεκτροδίου, εµφανίστηκαν δυο πολύ καλά σχηµατισµένες κορυφές, οι οποίεςαποδόθηκαν στην οξείδωση των καταλοίπων της γουανίνης και της αδενίνης τουµορίου του dsDNA. Με βάση το σήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενεςαναλυτικές συνθήκες, πολύ χαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούνµετά από σύντοµο χρόνο ακινητοποίησης και µε όριο ανίχνευσης ίσο µε 0,249 mg L-1, χρησιµοποιώντας την τεχνική της προσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίαςδιαφορικού παλµού (AdSDPV). Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ του DNA και των διαφόρων επιφανειοδραστικώνχηµικών οντοτήτων έχουν µελετηθεί εκτεταµένα τα τελευταία χρόνια. Πρόσφαταένας µεγάλος αριθµός δηµοσιευµένων µελετών, σχετικά µε το θέµα της σύνδεσης τουDNA µε τις επιφανειοδραστικές ουσίες, αναφέρουν ότι το DNA µπορεί νασχηµατίσει σταθερά σύµπλοκα µε τις τασενεργές ουσίες, µέσω υδρόφοβων ήηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων.Αξιοποιώντας λοιπόν, την ισχυρή αυτή αλληλεπίδραση, στο τελευταίοκοµµάτι της εργασίας, χρησιµοποιήθηκε ως βάση για την περαιτέρω τροποποίηση µεκατιονικές τασενεργές ουσίες · το βρωµιούχο δωδεκυλοτριµεθυλαµµώνιο (DTAB)και το βρωµιούχο τετραδεκυλοτριµεθυλαµµώνιο (TTAB), ένα ηλεκτρόδιο πάσταςάνθρακα τροποποιηµένο µε νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλών τοιχωµάτων(MWNTs/CPE)). Τα ηλεκτρόδια DTAB/MWNTs/CPE και ΤTAB/MWNTs/CPEχρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό του dsDNA. Συγκρίνοντας, την απόδοσητων ηλεκτροδίων αυτών και του ηλεκτροδίου MWNTs/CPE, αναφορικά µε τα όριαανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, διαπιστώθηκε µεγάλη βελτίωση. Σύµφωνα µε τααποτελέσµατα, η παρουσία των κατιονικών τασιενεργών µπορεί να ενισχύσει τηνπροσρόφηση του dsDNA στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου MWNTs / CPE. Με βάσητο σήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενες αναλυτικές συνθήκες, πολύχαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούν µετά από σύντοµο χρόνοακινητοποίησης και µε όρια ανίχνευσης ίσα µε 0,650 mg L-1και 0,119 mg L-1,χρησιµοποιώντας την τεχνική της προσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίαςδιαφορικού παλµού (DPΑSV), για τα ηλεκτρόδια DTAB/MWNTs/CPE καιΤTAB/MWNTs/CPE, αντίστοιχα.Συµπερασµατικά, τα παραπάνω αποτελέσµατα υποδηλώνουν ότι ταηλεκτρόδια που κατασκευάστηκαν αποτελούν ένα πολλά υποσχόµενο εργαλείο γιατην ανάπτυξη ηλεκτροχηµικών βιοαισθητήρων µε διάφορες εφαρµογές, όπως ηανίχνευση του υβριδισµού και των διαφόρων τροποποιήσεων του DNA, σεφαρµακευτικές και περιβαλλοντικές αναλύσεις και στον ποιοτικό έλεγχο γενικότερα,αποφεύγοντας το υψηλό κόστος, τις χρονοβόρες και περίπλοκες διαδικασίες και τηχαµηλή ευαισθησία.