Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών DNA βιοαισθητήρων συνθετικών πολυνουκλεοτιδίων που περιέχουν ανάλογα βάσεων ή μεθυλιωμένη κυτοσίνη, αλληλεπιδράσεις με προφλαβίνη

Abstract

5-methyl-cytosine is a natural pyrimidine base, which substitutes for cytosine, particularly in CpG sequences. Methylation differences, extensive hyper- and hypo-methylation loci characterize cancerous versus non-cancerous DNA. Therefore a direct approach for studying the extent of methylation based on the physicochemical changes introduced by cytosine modification would greatly simplify the evaluation of global DNA methylation. This thesis is focused on the development of electrochemical biosensors for studying methylation of DNA. Synthetic DNAs, PCR products (amplicons) containing natural bases or analogue bases or 5-methyl-cytosine were used as methylation models. These PCR products were immobilized on the electrode surface in order to study their physicochemical properties and their differences in the interaction with proflavine, which is an intercalator. The analogue bases used were inosine, which is a guanosine derivative lacking an amine group in comparison with the chemical structure of guanosine and 7-deaza-guanosine, which is another guanosine derivative lacking nitrogen in comparison with guanosine. At the beginning the electrochemical behaviour of 2΄-deoxy-cytidine- 5΄-triphoshate (dCTP), 5-methyl-2΄-deoxy-cytidine-5΄-triphoshate (5m-dCTP), 2΄-deoxy-guanosine-5΄-triphoshate (dGTP), 2΄-deoxy-inosine-5΄-triphoshate (dITP) and 7-deaza-2΄-deoxy-guanosine-5΄-triphoshate (7-deaza-dGTP) was investigated in different pH by using carbon paste (CPE) and hanging mercury drop electrode (HMDE). Cyclic (CV), differential pulse (DPV), square wave (SWV) and alternating current (ACV) voltammetry were used for this analysis. It was observed that all these mononucleotides were not adsorbed at the electrode surface and it was necessary to use high quantities in order to properly investigate them. Next, PCR products containing at some percentage 5m-dCTP, dITP and 7-deaza-dGTP were synthesized by substituting the native bases during PCR amplification. Synthesis of the above amplicons was followed by melting curve analysis using SYBR Green I. Analogue bases were most efficiently incorporated in amplicons when 60% of the natural bases were substituted by analogue bases. Fluorometric measurements revealed that incorporation of 5m-dCTP was followed by an increase of the melting temperature (Tm), while incorporation of dITP and 7-deaza-dGTP was followed by a decrease of Tm, indicating that 5m-dCTP led to helical stabilization. Electrochemical analysis of these amplicons was the next step of this study. The electrochemical behaviour of native double stranded DNA has been thoroughly investigated. Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry (AdTSV) is the method that is mainly used in the study of nucleic acids, since nucleic acids are surface-active substances. In particular guanine is oxidized on graphite electrodes and yields a peak at 1.00 V by using differential pulse voltammetry. The same peak was observed in the synthesized amplicons using carbon paste electrode, but there was a difference in the peak current intensity when the electrode surface was saturated by these amlicons. Amplicons containing 5m-dCTP yielded a little lower peak than native amplicons indicating that fewer guanine residues were exposed to the electrode surface, probably due to a more compact structure. Inosine-containing amplicons yielded even lower peak than amplicons containing 5m-dCTP, because of the substantial number of guanine molecules substituted by inosine, which is electrochemically inactive at 1.00 V. In conclusion, DPV was found to be useful in differentiating between model DNA systems containing inosine and methyl-cytosine. Proflavine, which is an intercalator, and the interaction of proflavine with calf thymus DNA was investigated electrochemically. It is known that DNA interacts with a broad range of low molecular mass organic compounds, such as carcinogens, drugs and environmental pollutants. Alterations of DNA electrochemical behaviour upon interaction with these compounds can be detected by using DPV, since changes are observed in the characteristic peak of DNA. Our study revealed according to references that proflavine intercalates within the DNA helix and induces conformational changes, since the characteristic peak of guanine’s oxidation at 1.00 V decreased by increasing the concentration of proflavine. ............................

Η 5-μεθυλο-κυτοσίνη είναι φυσική βάση πυριμιδίνης, ανάλογη της κυτοσίνης, η οποία την αντικαθιστά κυρίως σε αλληλουχίες CpG. Διαφοροποιήσεις στη μεθυλίωση, υπομεθυλίωση και υπερμεθυλίωση του DNA παρατηρούνται στον καρκίνο. Μία απευθείας προσέγγιση για τη μελέτη της έκτασης της μεθυλίωσης βασισμένη στις φυσικοχημικές αλλαγές που επιφέρει η μεθυλο-κυτοσίνη θα απλοποιούσε σημαντικά την αποτίμηση της συνολικής μεθυλίωσης στο DNA. Ο σκοπός της διατριβής αυτής είναι η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων για τη μελέτη της μεθυλίωσης στο DNA. Ως μοντέλα μεθυλίωσης χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά DNAs, προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR products-amplicons), τα οποία περιείχαν είτε φυσικές βάσεις, είτε ανάλογα βάσεων, είτε το φυσικό ανάλογο 5-μεθυλο-κυτοσίνη. Τα συνθετικά αυτά DNAs ακινητοποιήθηκαν στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, ώστε να μελετηθούν οι φυσικοχημικές ιδιότητές τους, καθώς και οι διαφοροποιήσεις στην αλληλεπίδρασή τους με την προφλαβίνη, η οποία είναι μία ένωση που παρεμβάλλεται στο DNA. Τα ανάλογα βάσεων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η ινοσίνη, η οποία είναι ένα παράγωγο της γουανοσίνης, όπου λείπει μια αμινομάδα σε σχέση με τη δομή της γουανοσίνης και η 7-δεαζα-γουανοσίνη, η οποία είναι πάλι ένα παράγωγο της γουανοσίνης, όπου λείπει το άζωτο στη θέση 7 σε σχέση με τη γουανοσίνη. Αρχικά έγινε μελέτη της ηλεκτροχημικής συμπεριφοράς των τριφωσφορικών εστέρων των 2΄-δεοξυ-κυτιδίνης (dCTP), 5-μεθυλο-2΄-δεοξυ-κυτιδίνης (5m-dCTP), 2΄-δεοξυ-γουανοσίνης (dGTP), 2΄-δεοξυ-ινοσίνης (dITP) και 7-δεαζα-2΄-δεοξυ-γουανοσίνης (7-deaza-dGTP) σε διάφορα pH, χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα (CPE) και κρεμάμενης σταγόνας υδραργύρου (HMDE). Κυκλική (CV), διαφορικού παλμού (DPV), τετραγωνικού παλμού (SWV) και εναλλασσόμενου ρεύματος (ACV) βολταμμετρία χρησιμοποιήθηκαν για αυτήν την ανάλυση. Παρατηρήθηκε, ότι οι παραπάνω τριφωσφορικοί εστέρες δεν είναι δυνατό να προσροφηθούν στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, πιθανόν λόγω παρεμπόδισης των τριφωσφορικών ομάδων. Το επόμενο βήμα ήταν η σύνθεση προϊόντων PCR αντικαθιστώντας τις φυσικές βάσεις με 5m-dCTP, dITP και 7-deaza-dGTP κατά τη διάρκεια της PCR. Ακολούθησε η ανάλυση τους με μέτρηση της θερμοκρασίας τήξης (Τm) με χρήση του SYBR Green I. Τα ανάλογα βάσεων ενσωματώθηκαν καλύτερα στα προϊόντα της PCR, όταν 60% των φυσικών βάσεων αντικαταστάθηκε από τα ανάλογα βάσεων κατά τη διάρκεια της PCR. Οι φθορισμομετρικές μετρήσεις των προϊόντων αυτών με θερμική αποδιάταξη παρουσία της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I έδειξαν ότι η ενσωμάτωση της 5m-dCTP οδηγεί σε αύξηση της θερμοκρασίας τήξης, ενώ η ενσωμάτωση των dITP και 7-deaza-dGTP σε μείωση της Τm. Το γεγονός αυτό είναι ενδεικτικό της σταθεροποίησης της διπλής έλικας που οφείλεται στη εισαγωγή της 5m-dCTP στο μόριο. Ακολούθησε η ηλεκτροχημική μελέτη των προϊόντων PCR που συντέθηκαν. Η ηλεκτροχημική συμπεριφορά του δίκλωνου DNA έχει ερευνηθεί διεξοδικά. Η προσροφητική αναδιαλυτική βολταμμετρία αλλαγής μέσου (AdTSV) χρησιμοποιείται συνήθως στη μελέτη των νουκλεϊνικών οξέων, επειδή είναι ενώσεις που προσροφώνται στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Συγκεκριμένα η γουανίνη οξειδώνεται σε ηλεκτρόδια άνθρακα και δίνει κορυφή στο 1,00 V με βολταμμετρία διαφορικού παλμού. Τα προϊόντα PCR μελετήθηκαν με ηλεκτρόδιο πάστας άνθρακα και παρατηρήθηκε η ίδια κορυφή οξείδωσης της γουανίνης στο 1,00 V, αλλά υπήρχε διαφορά στην ένταση ρεύματος της κορυφής, όταν η επιφάνεια του ηλεκτροδίου ήταν κορεσμένη με τα προϊόντα PCR. Τα προϊόντα που περιείχαν 5m-dCTP έδωσαν χαμηλότερη κορυφή σε σχέση με τα φυσιολογικά προϊόντα της PCR (χωρίς ανάλογα βάσεων), υποδεικνύοντας, ότι λιγότερα μόρια γουανίνης ήταν εκτεθειμένα στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, πιθανόν λόγω πιο συμπαγούς δομής. Τα προϊόντα που περιείχαν ινοσίνη έδωσαν ακόμα χαμηλότερη κορυφή σε σχέση με τα προϊόντα που περιείχαν 5m-dCTP, λόγω του σημαντικού αριθμού μορίων της γουανίνης που είχαν υποκατασταθεί από ινοσίνη, η οποία είναι ηλεκτροχημικά ανενεργή στο 1,00 V. .............................