Επίδραση αντιμυκητιασικών φαρμάκων στην αιμοποίηση, in vitro και in vivo, παρουσία κυτοκινών

Abstract

Liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin represent three antifungals widely used in clinical practice. They show less toxicity for various cell types, comparatively with the toxic and thus of limited clinical use older form of amphotericin B. However, their effect on hematopoietic cells remains unclarified. The aim of this thesis was to investigate the effect of the three modern antifungals on hematopoietic cells. Mouse bone marrow cells and bone marrow or mobilized peripheral blood or umbilical cord blood mononuclear cells from healthy donors were cultured in semisolid methylcellulose medium with or without cytokines, as a cocktail or single [stem cell factor, interleukin-3, interleukin-6, granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), erythropoietin], in the presence or absence of various concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin. After the end of the incubation, the formed colonies of mature cells were counted [colony forming unit granulocyte or/and macrophage (CFU-GM), burst forming unit erythroid (BFU-E), CFU-E, CFU-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte (CFU-GEMM)]. Moreover, after the incubation, methylcellulose cultures with and without the antifungals were inspected microscopically for potential contamination and were plated and incubated onto fungal growth agar media. Furthermore, the trough peripheral blood levels of various daily administered doses of the three modern antifungals were determined by drug diffusion bioassays on agar and potential toxicity symptoms (pain, weight loss, death) were simultaneously monitored in mice, followed by observation for potential toxicity in sublethally irradiated mice. Additionally, the absolute number of blood granulocytes was determined by flow cytometry at specific time points during the recovery in sublethally irradiated mice that were not receiving or were daily receiving liposomal amphotericin B, voriconazole, caspofungin, G-CSF and G-CSF+drug. In vitro, the three modern antifungals were non-toxic for hematopoietic cells and, interestingly, they significantly increased the CFU-GM colony number in the presence of cytokines. In contrast, amphotericin B deoxycholate caused a concentration-dependent toxicity and significant decrease of the number of colonies. Moreover, the modern antifungals’ effect was not due to their antifungal properties, since no fungi were detected in all cultures tested. In vivo, the modern drugs were non-toxic for granulocytes at the maximum well-tolerated doses. Furthermore, they induced no significant change in the number of granulocytes during the recovery. Additionally, G-CSF+caspofungin significantly increased the number of granulocytes, G-CSF+voriconazole caused an increase that was not statistically significant and G-CSF+liposomal amphotericin B induced a smaller than the previous combinations and non-statistically significant increase, comparatively with G-CSF. Conclusively, a possible positive effect of the three modern antifungals on hematopoiesis, acting on specific hematopoietic cells, in the presence of cytokines, is shown. These data are of particular interest, as they indicate a possible different mode of action for these drugs, apart from their antifungal activity. Thus, they contribute, on the one hand, to the knowledge acquisition in the context of the broader understanding of the antifungals’ effect on hematopoiesis, and on the other hand, to the demonstration of the significance that these widely used antifungals could have as therapeutic and prophylactic options for severe infections mainly in organisms with decreased defense.

H λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη αποτελούν τρία αντιμυκητιασικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πρακτική. Αυτά παρουσιάζουν μικρότερη τοξικότητα για διάφορους τύπους κυττάρων, συγκριτικά με την τοξική και έτσι περιορισμένης κλινικής χρήσης παλαιότερη μορφή της αμφοτερικίνης Β. Ωστόσο, η δράση τους σε αιμοποιητικά κύτταρα παραμένει αδιευκρίνιστη. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών σε αιμοποιητικά κύτταρα. Kύτταρα μυελού των οστών ποντικών και μονοπυρηνικά κύτταρα μυελού των οστών ή κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ή ομφαλιοπλακουντικού αίματος υγιών δοτών καλλιεργούνταν σε ημιστερεό μέσο μεθυλκυτταρίνης με ή χωρίς κυτοκίνες, ως κοκτέιλ ή μεμονωμένες [παράγοντας αρχέγονων κυττάρων, ιντερλευκίνη-3, ιντερλευκίνη-6, παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων, παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων (G-CSF), ερυθροποιητίνη], παρουσία ή απουσία διάφορων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης. Μετά το τέλος της επώασης, καταμετρούνταν οι αποικίες ώριμων κυττάρων που δημιουργούνταν [μονάδα που δημιουργεί αποικία κοκκιοκυττάρων ή/και μακροφάγων (CFU-GM), μονάδα που δημιουργεί έκρηξη ερυθροειδών (BFU-E), CFU-Ε, CFU-κοκκιοκυττάρων-ερυθροειδών-μακροφάγων-μεγακαρυοκυττάρων (CFU-GEMM)]. Ακόμη, μετά την επώαση, καλλιέργειες μεθυλκυτταρίνης με και χωρίς τα αντιμυκητιασικά ελέγχονταν μικροσκοπικά για τυχόν ύπαρξη μόλυνσης και επιστρώνονταν και επωάζονταν σε αγαρούχα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης μυκήτων. Επίσης, τα ελάχιστα επίπεδα στο περιφερικό αίμα διάφορων καθημερινώς χορηγούμενων δόσεων των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών προσδιορίζονταν με μικροβιολογικές μεθόδους διάχυσης φαρμάκου σε άγαρ και ταυτόχρονα παρακολουθούνταν τυχόν συμπτώματα τοξικότητας (πόνος, απώλεια βάρους, θάνατος) σε ποντίκια, ενώ ακολουθούσε παρακολούθηση τυχόν τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια. Επιπλέον, ο απόλυτος αριθμός των κοκκιοκυττάρων του αίματος προσδιοριζόταν με κυτταρομετρία ροής σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές κατά την ανάκαμψη σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια που δε λάμβαναν ή λάμβαναν καθημερινά λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, βορικοναζόλη, κασποφουγκίνη, G-CSF και G-CSF+φάρμακο. In vitro, τα τρία νεότερα αντιμυκητιασικά δεν ήταν τοξικά για τα αιμοποιητικά κύτταρα ενώ, κατά ενδιαφέροντα τρόπο, προκάλεσαν σημαντική αύξηση του αριθμού των CFU-GM αποικιών παρουσία κυτοκινών. Αντίθετα, η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα και σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών. Ακόμη, αυτή η επίδραση των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών δεν ήταν απόρροια των αντιμυκητικών ιδιοτήτων τους, μιας και δεν ανιχνεύθηκαν μύκητες σε όλες τις καλλιέργειες που εξετάστηκαν. In vivo, τα τρία νεότερα φάρμακα δεν ήταν τοξικά για τα κοκκιοκύτταρα στις μέγιστες καλά ανεκτές δόσεις. Επίσης, αυτά προκάλεσαν μη σημαντική μεταβολή του αριθμού των κοκκιοκυττάρων κατά την ανάκαμψη. Επιπλέον, ο συνδυασμός G-CSF+κασποφουγκίνη προκάλεσε σημαντική αύξηση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων, ο G-CSF+βορικοναζόλη επέφερε μια αύξηση μη στατιστικά σημαντική και ο G-CSF+λιποσωμική αμφοτερικίνη Β προκάλεσε μια μικρότερη από τους προηγούμενους συνδυασμούς και μη στατιστικά σημαντική αύξηση, συγκριτικά με τον G-CSF. Συμπερασματικά, φαίνεται μια πιθανή θετική επίδραση των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών στην αιμοποίηση, δρώντας σε συγκεκριμένα αιμοποιητικά κύτταρα, παρουσία κυτοκινών. Αυτά τα δεδομένα παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς υποδεικνύουν έναν πιθανό διαφορετικό τρόπο δράσης για αυτά τα φάρμακα, πέρα από την αντιμυκητική λειτουργία τους. Έτσι, συμβάλλουν, αφενός, στην απόκτηση γνώσης στο πλαίσιο της ευρύτερης κατανόησης της δράσης αυτών στην αιμοποίηση, και αφετέρου, στην κατάδειξη της σημασίας που θα μπορούσαν να έχουν αυτά τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιμυκητιασικά ως θεραπευτικές και προφυλακτικές επιλογές για τις σοβαρές λοιμώξεις κυρίως στους οργανισμούς με μειωμένη άμυνα.