Νεύρωση του ώμου: προσδιορισμός των λεπτών νευρικών δομών του τενόντιου πετάλου των στροφέων με μεθόδους ανοσοφθορισμού και ανοσοϊστοχημείας και ερμηνεία της ανάπτυξης κλινικών συμπτωμάτων

Abstract

The rotator cuff is the dynamic stabilizer of the glunohumeral joint. It is a complex of tendons, which covers the shoulder joint and it is inserted at the humerus. The supraspinatus, the infraspinatus, the teres minor, the subscapularis and the long head of biceps tendon construct the rotator cuff. Rotator cuff tears are extremely common. Cadaver studies in the elderly estimate the prevalence of rotator cuff tears to be from 20-35%. The prevalence of full thickness tears is 30% and the rest 70% represent partial tears. Rotator cuff tears, as well as, the preceding degenerative disorder are the most frequently causes of dysfunction and pain in the shoulder in patients above 40 years old. Rotator cuff tears commonly accompanies with pain when they are associated with long head of biceps (LHB) lesions. It is also known that spontaneously or surgical resection of the LHB leads to pain relief. Based on these observations we could easily assume that the LHB is responsible for the pain in these patients rather than the rotator cuff tear itself. Some authors believe that a possible explanation could be a repeatedly tendon injury due to an ongoing subacromial impingement of the LHB. Others suggest that the nervous system contributes to the development of the clinical picture. Recently, the term tendinosis has been introduced in order to describe the degenerative changes, which happen in the tendon when the mechanical stress exceeds the normal tolerance of the tissue. In that case the tendon fails to develop the appropriate healing process. The chronic tendon disorders (tendinosis) have not been fully understood. The term tendonitis has been used to describe them. However, histopathological studies did not succeed to reveal the presence of inflammatory cells, which illustrate the acute inflammatory conditions. Therefore, tendinosis appears to be a degenerative process that is characterized by the presence of dense populations of fibroblasts, disorganized extracellular matrix and vascular hyperplasia. In order to investigate the pathogenesis of tendinosis we divided our research into two directions: 1) we have tried to clarify why tendinosis is painful given the absence of acute inflammatory cells; 2) and to examine the causes which prevent tendon healing. For this purpose we studied the potential role of the nervous system as well as the role of apoptosis in the long head of the biceps tendon. The nervous system plays a major in the pathogenesis of the so- called "Neurogenic Inflammation". Neuropeptides such as substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP), besides transmitting the pain they participate in vasodilation, plasma extravagation and cytokines release. Furthermore there is evidence that sympathetic fibers contribute to the above regulatory system. Imbalances between vasoconstrictor (TH) and vasodilator (SP, CGRP) mediators may lead to abnormal perfusion, nutritional deficiency, ischemia and hypoxic degeneration. The nervous system could be involved in the pathophysiology of LHB tendinosis as a result of the action of the cell adhesion molecules. The cell adhesion molecules are extremely important to maintain the architecture of the nervous system. Additionally, a recent study report that cell adhesion molecule L1 CAM is involved in the mechanisms oh neuropathic pain. Regarding the impaired healing capacity, which characterizes tendinosis, many authors believe that apoptosis represent the heart of the problem. Apoptosis, or programmed cell death is an extremely significant physiological process. It is an important component of embryogenesis and organogenesis. It is also vital in the maintenance of homeostasis in many adult tissue through the control of cell population. Apoptosis is highly regulated by biochemical pathways, which consequence to intracellular events (mitochondria alterations, nuclear fragmentation) eventually leading to cell death. Using immunohistochemical techniques in paraffin and frozen sections as well as Western Blots techniques we investigated the sensory and sympathetic innervation and the expression of the L1 CAM in LHB. Finally we tried to evaluate the involvement of apoptosis in LHB tendinosis. We used neurofilament (NF) antibody as a general marker, calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP), for the sensory fibers and tyrosine hydroxylase (TH) to detect the sympathetic nerve fibers. Bad, Bax and Bcl2 antibodies were used to assess the apoptosis. L1 CAM antibody was used to detect the expression of this specific protein. We used tissue (LHB) harvested from cadavers as well as from patients undergoing LHB tenotomy. Neurofilament, SP, CGRP and TH antibodies revealed a rich innervation, which was more common at the proximal insertion to the bone than at the distal tendomuscular junction. The staining patterns with all antibodies appeared identical showing a thin interconnected network of nerve fibers. Using L1 CAM antibody we revealed the expression of L1 CAM in human tendons. To our knowledge this the first report of L1 CAM expression in human tendons. We also investigated apoptosis in LHB by using Bad, Bax and Bcl2 antibodies. Unfortunately we were not able to detect excessive apoptosis in degenerative LHB tissue compared with the control group. In summary, the findings of this study are: 1) The LHB contains a large network of sensory sympathetic nerve fibers, which is not associated with blood vessels, as it has been described in previous studies. 2) The distribution of this innervation is heterogeneous, since it is present rather in the bone insertion side of the tendon. 3) The L1 CAM protein is expressed in the human tendons. 4) We failed to reveal that excessive apoptosis is present in LHB disorders. These results may attributes to factors, which may play a certain role such as patients’ age. In conclusion: Our findings may give a possible explanation for the role of LHB in the pathogenesis of shoulder pain in patients with concomitant impingement syndrome or rotator cuff tear.

Το πέταλο των στροφέων του ώμου είναι μία απονεύρωση από κοινούς καταφυτικούς τένοντες, που καλύπτει την κορυφή του θυλάκου της άρθρωσης του ώμου και καταφύεται στο μείζον βραχιόνιο όγκωμα. Σχηματίζεται από τον τένοντα του υποπλατίου, του υπακανθίου, του υπερακανθίου, του ελάσσονος στρογγύλου και της μακράς κεφαλής του δικέφαλου βραχιονίου μυός. Οι ρήξεις του πετάλου των στροφέων στην άρθρωση του ώμου αποτελούν ένα εξαιρετικά συχνό φαινόμενο και υπολογίζεται ότι σε πτωματικές μελέτες ανευρίσκονται σε ποσοστό 20-35%. Επί του συνόλου των ρήξεων το 30% είναι πλήρεις ενώ το υπόλοιπο αναφέρεται σε μερικές ρήξεις. Οι ρήξεις του πετάλου των στροφέων καθώς και η προηγηθείσα της ρήξης χρόνια εκφυλιστική βλάβη, αποτελούν την συχνότερη αιτία νοσηρότητας και πόνου στον ώμο σε άτομα άνω των 40 ετών. Ασθενείς με εκφυλιστικής αρχής ρήξη του στροφικού πετάλου εμφανίζουν πόνο όταν συνυπάρχει τενοντίτιδα του τένοντα της μακράς κεφαλής του δικέφαλου (LHB). Επίσης έχει παρατηρηθεί ότι αυτόματη ρήξηή τενοτομή του τένοντα της LHB προκαλεί ύφεση του πόνου. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις θα μπορούσε κάποιος να υποθέσει ότι τα συμπτώματα αποδίδονται σε συμμετοχή του τένοντα της LHB (ενδοαρθρικά) και όχι στη ρήξη του στροφικού πετάλου καθ’ αυτήν. Μια πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι το γεγονός ότι ο τένοντας της LHB υπόκειται σε διαρκή ερεθισμό λόγω της ενδοαρθρικής πορείας του, σε αντίθεση με το τενόντιο πέταλο, το οποίο αν και δεν επουλώνεται μετά τη ρήξη, εντούτοις δεν υποβάλλεται σε συνεχή μηχανικό ερεθισμό. Μια άλλη εξήγηση θα ήτανη ύπαρξη συγκεκριμένων νευρικών δομών που συμμετέχουν στην δημιουργία του κλινικού συνδρόμου. Ο όρος tendinosis έχει χρησιμοποιηθεί για να περιγράψει αυτού του είδους τιςεκφυλιστικές μεταβολές που συμβαίνουν όταν ο τένοντας υφίσταται μηχανικό στρες που υπερβαίνει τη φυσική του αντοχή και αδυνατεί να αναπτύξει ικανοποιητικούς επουλωτικούς μηχανισμούς. Οι χρόνιες βλάβες (tendinosis) δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Αν και πολύ συχνά χρησιμοποιείται ο όρος τενοντίτιδα για τις περιγράψει οι ιστοπαθολογικές μελέτες απέτυχαν να αποκαλύψουν την ύπαρξη ικανού αριθμού φλεγμονωδών κυττάρων που θα τις κατέτασσε στις οξείες φλεγμονές. Επομένως θα μπορούσε κάποιος να πει ότι πρόκειται για μια εκφυλιστική διαδικασία πουχαρακτηρίζεται από την παρουσία αυξημένου αριθμού ινοβλαστών, αποδιοργανωμένης εξωκυττάριας ουσίας και αγγειακής υπερπλασίας. Προσπαθώντας να κατανοήσουμε την παθοφυσιολογία αυτής της οντότητας εστιάσαμε στη διερεύνηση δύο κυρίως σημείων: 1) Γιατί οι καταστάσεις αυτές είναι επώδυνες (αφού στερούνται φλεγμονωδών κυττάρων); και 2) γιατί ο τένοντας αποτυγχάνει να επουλωθεί. Για να απαντήσουμε στα ερωτήματα αυτά διερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο του νευρικού συστήματος μέσω δράσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών και τον ρόλο της απόπτωσης στον τένοντα της μακράς κεφαλής του δικέφαλου. Το νευρικό σύστημα παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της καλούμενης “νευρογενούς φλεγμονής”. Νευροπεπτίδια όπως substance P (SP) και calcitonin gene-related peptide (CGRP), που ανευρίσκονται στις αισθητικές ίνες εκτός από την μεταβίβαση του πόνου συμμετέχουν στην ρύθμιση της αιματικής ροής σε τοπικό επίπεδο καθώς και στην απελευθέρωση κυττοκινών. Επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις ότι οι συμπαθητικές νευρικές ίνες αποτελούν μέρος του ρυθμιστικού συστήματος. Ανισορροπία ανάμεσα σε αγγειοσυσπαστικούς (Tyrosine hydroxylase-ΤΗ) και αγγειοδιασταλτικούς παράγοντες όπως substance P (SP) και calcitonin gene-related peptide (CGRP), μπορεί να οδηγήσουν σε τοπική ισχαιμία και κατ’ επέκταση σεεκφύλιση του τένοντα. Το νευρικό σύστημα θα μπορούσε να εμπλέκεται στην παθογένεια της tendinosis στον LHB μέσω της δράσης των πρωτεϊνών κυτταρικής συνάφειας. Τα μόρια αυτά έχουν εξαιρετική σημασία στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής του νευρικού συστήματος. Επιπλέον, πρόσφατη μελέτη αποδίδει σε εκπροσώπους της οικογένειας των πρωτεϊνών αυτών (L1 CAM) συμμετοχή στους μηχανισμούς ανάπτυξης του νευροπαθητικού πόνου. Όσον αφορά στην αδυναμία επούλωσης του τένοντα, πολλοί ερευνητές έχουν δείξει τα τελευταία χρόνια ότι τόσο το οξειδωτικό στρες όσο και η απόπτωση εμπλέκονται στη εκφύλιση και ρήξη. Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μια φυσιολογική διαδικασία εξαιρετικής σπουδαιότητας τόσο κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης όσο και κατά την ενήλικη ζωή μέσω του ελέγχου που ασκεί στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων. Χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένους βιοχημικέςοδούς των οποίων η ενεργοποίηση οδηγεί σε κυτταρικές μορφολογικές μεταβολές (αλλαγές στα μιτοχόνδρια, την κυτταρική μεμβράνη, διάσπαση του πυρήνα) και τελικά σε ρίκνωση και λύση του κυττάρου. Χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοϊστοχημείας (σε τομές παραφίνης και κρυοτομές)καθώς και ανοσοαποτύπωσης (Western Blots) ερευνήθηκε η αισθητική και συμπαθητική νεύρωση του τένοντα της μακράς κεφαλής του δικέφαλου, η έκφραση του μορίου κυτταρικής συνάφειας L1 CAM και τέλος αξιολογήθηκε ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήσαμε ήταν έναντι των πρωτινών substance P (SP) και calcitonin gene-related peptide (CGRP) για την αισθητική νεύρωση, tyrosine hydroxylase (TH) για την συμπαθητική νεύρωση,neurofilament (NF) ως γενικός δείκτης, Bad, Bax και Bcl2 για την αξιολόγηση της απόπτωσης και L1 CAM για την ανίχνευση της έκφρασης της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε υλικό (τένοντας της LHB) από πτωματικούς δότες αλλά και από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε τενοτομή του LHB. Η εφαρμογή των αντισωμάτων (SP), (CGRP) για την αισθητική νεύρωση, (TH) για την συμπαθητική νεύρωση και NF αποκάλυψε την ύπαρξη ενός πλούσιου νευρικού δικτύου το οποίο εμφάνισε άνιση κατανομή κατά μήκος του τένοντα με συχνότερη την ανεύρεση του στο κεντρικό τμήμα του τένοντα. Η εφαρμογή του αντισώματος αντι- L1 CAM αποκάλυψε για πρώτη φορά την έκφραση της πρωτεΐνης αυτής στο συγκεκριμένο ιστό. Η εφαρμογή των αντισωμάτων Bad, Bax και Bcl2 για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου στον τένοντα της LHB δεν μπόρεσε να αποδείξει αύξηση της απόπτωσης στους τένοντες με εκφύλιση στο στροφικό πέταλου σε σύγκριση με το υλικό που ελήφθη από την ομάδα ελέγχου. Τα ευρήματα από την παραπάνω μελέτη συνοψίζονται ως εξής: 1) Ο τένοντας της μακράς κεφαλής του δικέφαλου περιέχει ένα εκτεταμένο δίκτυο αισθητικών και συμπαθητικών νευρικών ινών, που δεν σχετίζεται με τα αιμοφόρα αγγεία. 2) Η κατανομή αυτού του δικτύου είναι ετερογενής με το κεντρικό τμήμα του τένοντα να εμφανίζει πλουσιότερη νεύρωση. 3) Για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία ανιχνεύθηκε η έκφραση του μορίου κυτταρικής συνάφειας L1 CAM σε τενόντιο ιστό. 4) Η αποτυχία εντοπισμού διαφορών στον κυτταρικό θάνατο και εξαγωγής συμπερασμάτων σ’ αυτή τη φάση της μελέτης πιθανά να οφείλεται σε παράγοντες που σχετίζονται με την επιλογή των ασθενών που συμμετείχαν στην έρευνα (π.χ.μεγάλη ηλικία των ασθενών). Συμπέρασμα: Τα παραπάνω ευρήματα δίνουν μια πιθανή απάντηση για τον ρόλο του τένοντα της μακράς κεφαλής του δικέφαλου στο χρόνιο πόνο στον ώμο όταν συνυπάρχει ρήξη του πετάλου των στροφέων.