Μελέτη φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών κελυφωτών φιστικιών με στόχο τη μείωση της αφλατοξίνης

Abstract

Aflatoxins are the most prominent group of mycotoxins that derive from several species of fungi of the Aspergillus section Flavi group and contaminate several agricultural commodities, among them the pistachio nuts. They are considered as highly toxic compounds with carcinogenic and mutagenic effect in humans and animals. Hand or mechanical sorting of off-standard, low-quality nuts is currently applied as a preventive practice targeting in reducing aflatoxin concentration within legal limits in a lot of pistachio nuts. However, the efficacy of this measure is in doubt due to the fact that it is not based in sorting tools that are directly related with the presence of aflatoxin. This results in a high number of border rejections of lots with pistachio nuts during import in EU. The aim of the present thesis was to find suitable sorting tools for the separation of aflatoxin contaminated pistachio nuts. The principal concept was based upon the fact that contamination process and aflatoxin production affect the physical and the chemical characteristics of the substrate and alter its profile in a way that the resulting deviations can be detected. For this purpose, the physical and chemical properties of healthy, aflatoxin contaminated and off-standard pistachios were evaluated, in order to determine any distinguishable properties which would be a useful tool for the identification and rejection of aflatoxin contaminated and off-standard pistachios after harvest.The volatile profile of healthy, aflatoxin contaminated (naturally or artificially) and artificially contaminated pistachios with non-toxigenic strains of Aspergillus sc Flavi was determined. The volatiles were isolated by the HS-SPME method and determined by GC-FID and GC-MS, whereas aflatoxin was quantified by HPLC. Accordingly, some chemical characteristics such as protein, ash, fat content and fatty acids profile were determined in healthy, aflatoxin contaminated and off-standard pistachios. Protein, ash and fat contents were measured according to the standard AOAC methods and fatty acids were determined by trans-esterification into their corresponding fatty acid methyl-esters and measured using GC analysis. The evaluation of the physical properties was initially focused on obtaining the adsorption isotherm of whole shelled nut according to the official gravimetric method. Next, some geometrical (size, shape), gravimetrical (mass, volume, density), thermal (thermal conductivity), optical (color) and texture (puncture test) properties were studied, as a function of moisture content of the nut. Finally, the values for some the above mentioned properties were quantified for the local variety of pistachios «Aegina» and for several types of off-standard pistachios. The geometrical properties were defined by their characteristic dimensions and then calculated using available equations. Mass was measured in an analytical balance, while the solid displacement method was used for the determination of the apparent volume and density. Water content was measured according to the relevant AOAC method. Shell color parameters were quantified using a Minolta colorimeter and the thermal conductivity of the pistachio kernel was measured with a conductivity probe. A penetration test was conducted with an Instron Testing Machine in order to evaluate the texture parameters of the kernel of the nut. Multivariate statistical analysis, such as cluster analysis, principal component and discriminant analysis were performed to identify the groups of pistachio samples with similar volatile and chemical profile and see whether it is possible to separate the healthy samples from the contaminated and off-standard samples. One-way ANOVA was performed to determine if the mean for each physical or chemical tested property (univariate tests) was significantly different for healthy, aflatoxin contaminated and off-standard pistachios (among groups) and also, to compare the mean values of each property tested among samples of each group (within group). The respective means were compared using Tukey or LSD test at p≤0.05 at the 95% confidence limits. STATGRAPHICS® Centurion XV.II software was used to carry out all analyses.Seventy two volatile compounds were identified almost equally distributed among the above studied groups of the volatile profile. The predominant chemical compounds were monoterpenes, alcohols, ketones, aldehydes, esters and hydrocarbons. Even though the general volatile profile was similar among groups, some differences were detected between healthy and contaminated group of samples. All eight carbon (C-8) alcohols, ketones and aldehydes, sesquiterpenes, as well as the chemical compounds 1-pentanol, 1-heptanol and the aldehydes heptanal, 2-heptenal, 2-decenal, benzaldehyde and benzeneacetaldehyde were mainly isolated from contaminated samples suggesting that they were related to the presence of the causative fungi. No statistically significant differences among healthy, aflatoxin contaminated and off-standard pistachio kernels in protein and ash content as well as in fatty acid composition were found. On the contrary, the fat content of both off-standard and aflatoxin contaminated pistachios was lower than that of healthy pistachios. Additionally, a differentiation in the saturation level of the fatty acids was observed among groups, with the contaminated and off-standard samples showing a trend towards increasing unsaturation. The standard values for the above mentioned properties were established for the local variety of pistachios «Aegina» and the sorting criteria based on size, shape, weight and color that can be used to separate several types of off-standard pistachios were quantified. When the multivariate statistical approach was applied combining either the characteristic volatile patterns or the chemical profile of each group, a clear separation of the healthy samples was achieved. The statistical results also showed that the fatty acid composition was the main cause of variability among chemical properties. This evidence, as well as the key volatiles that were detected, provide potential tools for distinguishing aflatoxin contaminated samples.

Οι αφλατοξίνες είναι μυκοτοξίνες οι οποίες παράγονται από ορισμένα είδη μυκήτων της ομάδας Aspergillus section Flavi και μολύνουν διάφορα είδη τροφίμων, μεταξύ αυτών και τα κελυφωτά φιστίκια. Εμφανίζουν υψηλή τοξικότητα, καρκινογόνο και μεταλλαξιογόνο δράση στον άνθρωπο και τα ζώα. Μία καλή πρακτική που εφαρμόζεται ως προληπτικό μέτρο για τη μείωση της συγκέντρωσης της αφλατοξίνης σε μια παρτίδα είναι ο διαχωρισμός των ελαττωματικών καρπών, με αυτόματα μηχανικά συστήματα ή χειροδιαλογή. Ωστόσο, η διαλογή αυτή δε βασίζεται σε δείκτες μόλυνσης, χαρακτηριστικούς της παρουσίας της αφλατοξίνης, με αποτέλεσμα οι απορρίψεις παρτίδων κελυφωτών φιστικιών λόγω υπέρβασης των νομοθετικών ορίων αφλατοξίνης, να αποτελεί το πιο συχνό πρόβλημα στα σημεία εισαγωγής. Συνεπώς, η αναζήτηση των κατάλληλων εργαλείων διαλογής των μολυσμένων με αφλατοξίνη φιστικιών αποτελεί το βασικό σκοπό της παρούσας εργασίας. Η βασική ιδέα στηρίζεται στο ότι τα αποτελέσματα της μόλυνσης και της παρουσίας της αφλατοξίνης, πιθανόν να αποτυπώνονται στο τρόφιμο μέσω μεταβολών στις φυσικές και χημικές τους ιδιότητες, με τέτοιο τρόπο και σε τέτοιο βαθμό, ώστε να γίνονται αντιληπτές. Προς αυτή την κατεύθυνση μελετήθηκαν συγκριτικά, τα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά υγιών, μολυσμένων με αφλατοξίνη και ελαττωματικών καρπών, ώστε να προσδιοριστούν οι τυχόν διακριτές διαφορές και να διερευνηθεί η δυνατότητα χρήσης τους, ως «δείκτες» διαλογής. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε το πτητικό προφίλ των κελυφωτών φιστικιών σε τέσσερις ομάδες δειγμάτων: υγιή, μολυσμένα με αφλατοξίνη με φυσικό και τεχνητό τρόπο και με μη-τοξικογόνα στελέχη της ομάδας Aspergillus sc Flavi. Οι αναλύσεις των πτητικών πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο της HS-SPME και ανάλυση σε GC-FID και GC-MS, ενώ η μέτρηση της συγκέντρωσης της αφλατοξίνης στα μολυσμένα δείγματα έγινε με HPLC. Αντίστοιχα, μελετήθηκαν τα χημικά χαρακτηριστικά (πρωτεΐνη, τέφρα, λίπος, λιπαρά οξέα, πτητικές ουσίες) των κελυφωτών φιστικιών σε τρεις ομάδες δειγμάτων: υγιή, μολυσμένα με αφλατοξίνη και ελαττωματικά. Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη, τέφρα και λίπος πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις σχετικές επίσημες μεθόδους του AOAC, ενώ η ανάλυση των λιπαρών υλών πραγματοποιήθηκε σε αεριοχρωματογράφο (GC-FID), αφού είχε προηγηθεί η μετατροπή τους στους αντίστοιχους μεθυλ-εστέρες. Η μελέτη των φυσικών ιδιοτήτων εστιάστηκε στην κατασκευή της ισόθερμης καμπύλης υγρασίας ολόκληρου του καρπού με κέλυφος ακολουθώντας τη βαρυμετρική μέθοδο, στην αποτύπωση των τυπικών φυσικών χαρακτηριστικών των κελυφωτών φιστικιών της ποικιλίας «Αιγίνης» (σχήμα, μέγεθος, μάζα, όγκος, πυκνότητα, υγρασία, χρώμα, θερμική αγωγιμότητα, υφή) σε συνάρτηση με την υγρασία του καρπού και στον προσδιορισμό τους σε ελαττωματικούς καρπούς. Το μέγεθος και το σχήμα του καρπού προσδιορίστηκε βάσει των χαρακτηριστικών του διαστάσεων και των σχετικών εξισώσεων που περιγράφονται στη βιβλιογραφία. Ο προσδιορισμός της μάζας έγινε σε αναλυτικό ζυγό ακριβείας, ενώ για τον υπολογισμό του όγκου και της πυκνότητας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος εκτόπισης στερεού με τη χρήση μικρών γυάλινων σφαιριδίων. Για τη μέτρηση της υγρασίας ακολουθήθηκε η επίσημη μέθοδος AOAC 925.40. Το χρώμα του κελύφους μετρήθηκε με χρωματόμετρο Minolta και η θερμική αγωγιμότητα του σπέρματος του φιστικιού με αγωγιμόμετρο. Για τον προσδιορισμό των παραμέτρων της υφής, χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Instron σε δοκιμή διάτρησης στο σπέρμα του φιστικιού. Η επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων βασίστηκε στην πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση (ανάλυση σε συστάδες, ανάλυση κύριων συνιστωσών και διακριτική ανάλυση), ώστε να αξιολογηθεί η δυνατότητα ταξινόμησης και διαχωρισμού των υγιών φιστικιών από τα μολυσμένα και ελαττωματικά, βάσει των διαφορών που προέκυψαν από τη μελέτη των χαρακτηριστικών τους. Η μέθοδος της ανάλυσης διακύμανσης κατά ένα κριτήριο (One-way ANOVA), οι δοκιμές Tukey και LSD εφαρμόστηκαν για να διερευνηθεί αν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στις μέσες τιμές των χαρακτηριστικών που μετρήθηκαν μεταξύ και εντός των ομάδων των δειγμάτων. Οι επεξεργασίες πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό λογισμικό πακέτο STATGRAPHICS® Centurion XV.II.Από τη μελέτη του πτητικού προφίλ απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 72 πτητικές ουσίες συνολικά, με χαρακτηριστική την παρουσία αλκοολών, κετονών, αλδεϋδών, εστέρων, υδρογονανθράκων και μονοτερπενίων. Οι ενώσεις οι οποίες σχετίζονταν κυρίως με τα μολυσμένα δείγματα ήταν οι C-8 αλκοόλες-κετόνες-αλδεΰδες, ορισμένα σεσκιτερπένα και οι ουσίες, 1-πεντανόλη, 1-επτανόλη, επτανάλη, 2-επτενάλη, 2-δεκενάλη, βενζαλδεΰδη και βενζακεταλδεΰδη. Όσον αφορά το χημικό προφίλ, δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των υγιών, των μολυσμένων και των ελαττωματικών φιστικιών, συγκρίνοντας κάθε ένα επιμέρους χημικό χαρακτηριστικό, με εξαίρεση την περιεκτικότητα σε ολικό λίπος, του οποίου η εκατοστιαία περιεκτικότητα ήταν ελαφρώς μειωμένη στα μολυσμένα με αφλατοξίνη δείγματα και σε μια κατηγορία ελαττωματικών φιστικιών. Επισημάνθηκε επίσης, μια τάση αύξησης της περιεκτικότητας σε ακόρεστα λιπαρά οξέα, τόσο στα μολυσμένα με αφλατοξίνη δείγματα, όσο και στα ελαττωματικά. Προσδιορίζοντας το εύρος της τιμής της κάθε φυσικής ιδιότητας στους κανονικούς καρπούς καθορίστηκαν τα κριτήρια αποδοχής για τη διαλογή διαφόρων κατηγοριών ελαττωματικών καρπών. Ωστόσο, εφαρμόζοντας πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση των δεδομένων, τα δείγματα των υγιών φιστικιών διαχωρίστηκαν σαφώς από τα μολυσμένα και ελαττωματικά φιστίκια χρησιμοποιώντας ως δείκτες μόλυνσης είτε τις παραπάνω πτητικές ενώσεις είτε το σύνολο των χημικών ιδιοτήτων που μετρήθηκαν, με το προφίλ των λιπαρών οξέων να αποτελεί την κύρια αιτία της υπάρχουσας παραλλακτικότητας. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι ο συνδυασμός της παρουσίας κάποιων πτητικών ενώσεων με το προφίλ των λιπαρών οξέων, θα μπορούσε να αποτελεί ένα ενδεχόμενο κριτήριο ή δείκτη διαχωρισμού των υγιών από τα μολυσμένα με αφλατοξίνη και δευτερευόντως από τα ελαττωματικά φιστίκια.