Modelling spore germination and mycelium growth kinetics of fungi in yogurt-type environment

Abstract

The contamination and colonization of yogurt with fungi is probably the most important quality problem for yogurt products with significant economic implications for the dairy industry. The overall objective of the present PhD research was to develop effective predictive mycology tools that can be used for improving fungi control systems in yogurt production. The first part of the research focused on the construction of mathematical models to predict the effect of the storage temperature and inoculum size on the growth of 12 fungal species isolated from yogurt production environment. Significant differences on the temperature dependence of the mycelium growth between the tested species were observed. A detailed application scheme of the models for the selection of the appropriate conditions of the challenge tests for the detection of fungi presence in yogurt was designed. Considering that temperature fluctuations are often during distribution and storage of yogurt, the developed models were further validated under dynamic temperature conditions. After the above studies conducted at population level, the research was extended on evaluating and describing the fungal behavior at single spore level. Models describing the behavior of single fungal spores can lead to more realistic predictions, since, in practice, contamination of foods with fungi occurs at very low number of spores. The germination of fungal spores was monitored microscopically and the germination data were modeled with the aid of primary and secondary models. The germination of spores was also studied at various dynamic time-temperature conditions. The comparison between predicted and observed data showed that the germination of spores is strongly affected by the extent of the temperature shift, the percentage of germinated spores at the time of the shift and the fungal species. The relation between germination time and lag time of mycelium growth of individual spores was also studied by combining microscopic and macroscopic techniques. The growth of a large number of mycelia originating from single spores was monitored macroscopically for the estimation of mycelium lag time. The distributions of the measured mycelium lag time were found to be similar to the germination time distributions under the same conditions but shifted in time with the lag times showing a significant delay compared to germination times. In order to investigate the source of the above difference, a time-lapse microscopy method was developed providing videos with the behavior of single fungal spore from germination until mycelium formation. Beyond the scientific interest in understanding fungal behavior, the findings of this study can be directly applied by the yogurt industry to improve quality control systems. For example, the developed models can be used as the basis for the selection of the appropriate conditions of the challenge tests for fungi detection in yogurt. This scientifically based design of quality control tests can lead to a successful decision making for improving quality. In addition, the quantitative description of the variability in the single spore behavior can be used for assessing the risk of spoilage and developing risk-based quality management systems for yogurt type products.

Η επιμόλυνση και η αποίκηση της γιαούρτης με μύκητες είναι ίσως το πιο σημαντικό πρόβλημα ποιότητας για τα προϊόντα γιαούρτης με σημαντικές οικονομικές επιπτώσεις για τη βιομηχανία γάλακτος. Το βασικό αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής έρευνας ήταν η ανάπτυξη αποτελεσματικών εργαλείων ποσοτικής μυκητολογίας, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση των συστημάτων ελέγχου μυκήτων στην παραγωγή γιαούρτης. Το πρώτο μέρος της έρευνας επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων για την πρόβλεψη της επίδρασης της θερμοκρασίας και του επιπέδου εμβολίου στην ανάπτυξη 12 στελεχών διαφορετικών ειδών μυκήτων οι οποίοι απομονώθηκαν από το περιβάλλον παραγωγής γιαούρτης. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των στελεχών σχετικά με τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της μυκηλιακής τους αύξησης. Με βάση τα αποτελέσματα, αναπτύχθηκε ένα λεπτομερές σχέδιο εφαρμογής των μοντέλων για την επιλογή των κατάλληλων συνθηκών των δοκιμών ελέγχου για την παρουσία μυκήτων στη γιαούρτη. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι διακυμάνσεις της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της διανομής και αποθήκευσης της γιαούρτης αποτελούν συχνό φαινόμενο, τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν αξιολογήθηκαν περαιτέρω σε δυναμικές συνθήκες θερμοκρασίας. Μετά τις παραπάνω μελέτες που διεξήχθησαν σε υψηλό επίπεδο πληθυσμού σπορίων, η έρευνα επεκτάθηκε στην αξιολόγηση και περιγραφή της συμπεριφοράς μυκήτων σε επίπεδο μεμονωμένων σπορίων. Μοντέλα που περιγράφουν τη συμπεριφορά μεμονωμένων σπορίων μυκήτων μπορεί να οδηγήσουν σε πιο ρεαλιστικές προβλέψεις, δεδομένου ότι στην πράξη η επιμόλυνση των τροφίμων με μύκητες συμβαίνει από πολύ χαμηλούς αριθμούς σπορίων. Η εκβλάστηση σπορίων μυκήτων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά και τα δεδομένα εκβλάστησης μοντελοποιήθηκαν με τη βοήθεια πρωτογενών και δευτερογενών μοντέλων. Η εκβλάστηση των σπορίων μελετήθηκε, επίσης, σε διάφορες δυναμικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Η σύγκριση μεταξύ των προβλεπόμενων και παρατηρούμενων δεδομένων έδειξαν ότι η εκβλάστηση των σπορίων επηρεάζεται έντονα από το βαθμό της θερμοκρασιακής μεταβολής, το ποσοστό των εκβλαστημένων σπορίων τη στιγμή της μεταβολής της θερμοκρασίας, καθώς και από το είδος του μύκητα. Η σχέση μεταξύ του χρόνου εκβλάστησης και του χρόνου φάσης προσαρμογής της μυκηλιακής ανάπτυξης μεμονωμένων σπορίων μελετήθηκε επίσης με συνδυασμό μικροσκοπικών και μακροσκοπικών τεχνικών. Η αύξηση ενός μεγάλου αριθμού μυκηλίων που προέρχονται από μεμονωμένα σπόρια μελετήθηκε μακροσκοπικά για τον προσδιορισμό του χρόνου φάσης προσαρμογής. Παρατηρήθηκε πως οι κατανομές των χρόνων φάσης προσαρμογής παρουσίασαν μία σημαντική χρονική καθυστέρηση σε σχέση με τις κατανομές του χρόνου εκβλάστησης. Προκειμένου να διερευνηθεί η πηγή της παραπάνω διαφοράς αναπτύχθηκε μια μικροσκοπική μέθοδος συνεχούς παρατήρησης παρέχοντας βίντεο με την συμπεριφορά των μεμονωμένων σπορίων μυκήτων από την εκβλάστηση μέχρι το σχηματισμό μυκήλιων. Εκτός από το επιστημονικό ενδιαφέρον για την κατανόηση της συμπεριφοράς των μυκήτων, τα ευρήματα αυτής της έρευνας μπορούν να εφαρμοστούν άμεσα από τη βιομηχανία γιαούρτης για τη βελτίωση των συστημάτων ελέγχου της ποιότητας. Για παράδειγμα, τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βάση για την επιλογή των κατάλληλων συνθηκών των δοκιμών πρόκλησης για την ανίχνευση μυκήτων σε γιαούρτη. Μέτρα ελέγχου ποιότητας βασισμένα σε επιστημονικά δεδομένα μπορούν να οδηγήσουν σε μια επιτυχημένη διαδικασία λήψης αποφάσεων για τη βελτίωση της ποιότητας. Επιπλέον, η ποσοτική περιγραφή της παραλλακτικότητας στη συμπεριφορά μεμονωμένων σπορίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση επικινδυνότητας της αλλοίωσης και την ανάπτυξη δραστικών συστημάτων διαχείρισης ποιότητας για προϊόντα τύπου γιαούρτης.