Μελέτη έκφρασης του Nogo-A και του υποδοχέα του στην πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα

Abstract

Nogo-A, an inhibitor of neurite growth has been found to play an important role in the control of axonal regeneration following injury. The topology and identification of the protein have been studied in the central nervous system (CNS) in both normal tissue and after brain and spinal cord injury. This molecule is distributed in oligodendrocyte bodies in the layers of the myelin sheath, but also in neurons of adult animals and during their developing CNS. Nevertheless, knowledge about the NgR receptor and its complex carrying out the functional signal transduction, is limited. Since the expression of these molecules has not been investigated so far in demyelinating diseases, as part of this doctoral thesis the kinetics were studied in three intervals in MOG-induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice and were compared to normal animals. The techniques used cover the entire range of molecular and histochemical techniques; from histochemical routine stains such as hematoxylin-eosin to confocal and electron microscopy analysis. Double immunofluorescence was applied in 6μm paraffin sections in order to define their precise localization, using a variety of cell markers. Furthermore, degeneration and axonal regeneration processes within inflammatory foci were studied with APP and GAP-43 markers, respectively. The pathologoanatomical study revealed the presence of Nogo-A in oligodendrocytes and neurons while it was absent from astrocytes and macrophages. An initial reduction of the Nogo-A protein was observed ten days post-induction (preclinical phase) and in the center of inflammatory foci of the acute phase followed by an increase (p<0,001) in chronic phase. This pattern of expression was inversely correlated with axonal regeneration (GAP-43+ axons) and axonal injury (APP+ axons) in the acute phase. The NgR receptor complex exhibited lower levels of Nogo-A in general and its expression in areas of inflammation varied depending on the disease progression phase. In control mice the majority of the signal was detected in neurons (>80%), in the acute phase expression emanated from specific microglial/macrophagical populations (70-75%) while in chronic phase a large proportion (40-45%) of neurite or axonal outgrowth cones expressed NgR. In conclusion, the expression of Nogo-A is subjected to the inflammatory events that take place in the CNS during EAE course, thus allowing a "time-window" for localized axonal regeneration. Early down-regulation already seen from preclinical phase, insinuates a precondition state for the upcoming inflammation while the subsequent global up-regulation in chronic phase, even in areas unrelated to inflammatory foci, links the molecule to other developmental or cognitive functions. On the other hand, the NgR receptor complex regulation, arm this molecule with a dual role in EAE: neuroprotective and inhibitory, depending on the time being studied. Expression of NgR complex in "good" M2 microglia drives the cleansing of the area, a process aided by the entrenchment of Nogo-A in APP+ pathological axons while maintaining the regenerative GAP-43+ axons and the adjacent white matter intact.

O Nogo-A, ένας αναστολέας της νευριτικής ανάπτυξης, έχει βρεθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της νευραξονικής αναγέννησης μετά από τραυματισμό. Η χωρική χαρτογράφηση της πρωτεΐνης έχει πραγματοποιηθεί στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), τόσο φυσιολογικού ιστού όσο και στον μετά από τραυματισμό εγκέφαλο και νωτιαίο μυελό. Το μόριο αυτό κατανέμεται στα ολιγοδενδροκυτταρικά σώματα, στις στιβάδες του μυελινικού ελύτρου τους, αλλά και σε νευρώνες τόσο σε ενήλικα ζώα όσο και κατά την ανάπτυξη του ΚΝΣ. Λιγότερα ωστόσο είναι γνωστά για τον υποδοχέα του NgR και το σύμπλοκο με το οποίο διενεργείται λειτουργικά η μεταγωγή σήματος. Δεδομένου ότι η έκφραση των παραπάνω μορίων δεν έχει διερευνηθεί έως τώρα σε απομυελινωτικές νόσους, στα πλαίσια της διδακτορικής αυτής διατριβής μελετήθηκε η κινητική τους σε τρεις χρονικές φάσεις στην MOG-επαγόμενη πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ) σε C57BL/6 μύες και έγινε σύγκριση με φυσιολογικά πειραματόζωα. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν κάλυπταν όλο το εύρος μοριακών και ιστοχημικών τεχνικών, από ιστοχημικές χρώσεις ρουτίνας όπως αιματοξυλίνη-εοσίνη μέχρι και αναλύσεις συνεστιακής και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Για τον ακριβή εντοπισμό των μορίων, πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός σε τομές παραφίνης 6μm χρησιμοποιώντας μια ποικιλία κυτταρικών δεικτών. Επιπλέον, οι διαδικασίες εκφυλισμού και αξονικής αναγέννησης μελετήθηκαν με τους δείκτες APP και GAP-43, αντίστοιχα, με απώτερο σκοπό την εύρεση της σχέσης των μορίων εντός των φλεγμονωδών εστιών. Η παθολογοανατομική μελέτη επαλήθευσε την παρουσία του Nogo-A σε ολιγοδενδροκύτταρα και νευρώνες ενώ δε βρέθηκε σε αστροκύτταρα και μακροφάγα. Στο κέντρο των φλεγμονωδών εστιών, παρατηρήθηκε μία αρχική μείωση της Nogo-A πρωτεΐνης στην οξεία φάση, η οποία είχε ξεκινήσει ήδη 10 ημέρες μετά την επαγωγή (προκλινική φάση), με ακόλουθη έντονη αύξησή της (p<0,001) στη χρόνια φάση. Αυτό το πρότυπο έκφρασης εμφάνισε μια αντίστροφη σχέση με την αξονική αναγέννηση (GAP-43+ άξονες) και την αξονική βλάβη (APP+ άξονες) στην οξεία φάση. Το σύμπλοκο του υποδοχέα NgR, εμφανίστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα του Nogo-A και η έκφραση του στις περιοχές των φλεγμονών διαφοροποιείται ανάλογα με τη φάση της νόσου. Ενώ στους φυσιολογικούς μάρτυρες η πλειοψηφία του σήματος εντοπίστηκε στους νευρώνες (>80%), στην οξεία φάση προήλθε από συγκεκριμένους μικρογλοιακούς/μακροφαγικούς πληθυσμούς κυττάρων (70-75%) και στη χρόνια φάση εμφανίστηκε σε μεγάλο ποσοστό (40-45%) στον αυξητικό κώνο νευριτών/νευραξόνων. Συμπερασματικά, η έκφραση του Nogo-A μεταβάλλεται από τις φλεγμονώδεις διεργασίες στο ΚΝΣ κατά τη διάρκεια της ΠΑΕ, επιτρέποντας πιθανώς στην οξεία φάση ένα χρονικό "παράθυρο" για αξονική αναγέννηση. Η πρόωρη μείωση του ήδη από την προκλινική φάση, δηλώνει κατάσταση προετοιμασίας για την επερχόμενη φλεγμονή ενώ η καθολική αύξησή του στη χρόνια φάση ακόμα και σε περιοχές που δε σχετίζονται άμεσα με τη φλεγμονή, συνδέει το μόριο με λοιπές αναπτυξιακές ή γνωστικές λειτουργίες. Από την άλλη, η ρύθμιση που υφίσταται ο υποδοχέας NgR και ταυτόχρονα το σύμπλοκό του, το καθιστά ως μόριο με διττό ρόλο στην ΠΑΕ: νευροπροστατευτικό αλλά και ανασταλτικό, ανάλογα με τη χρονική στιγμή που μελετάται. Η έκφραση του NgR συμπλόκου στην “καλή” Μ2 μικρογλοία κινητοποιεί την εκάθαρση της περιοχής, μια διαδικασία που υποβοηθάται από την περιχαράκωση του Nogo-Α στους APP+ παθολογικούς άξονες, διατηρώντας παράλληλα τους GAP-43+ αναγεννημένους άξονες αλλά και τη γειτονική λευκή ουσία ακέραια.