Enhanced RNA interference - 1 - like - 1: το φυτικό ομόλογο των Eri-1 πρωτεϊνών συμμετέχει στην κατεργασία των ριβοσωμικών μεταγράφων του χλωροπλάστη

Abstract

Ribonucleases are involved in a variety of processes in all organisms, from viruses to higher eukaryotes performing essential roles in RNA transcription termination, maturation, editing, splicing and RNA silencing. Depending on their mode of action and some intrinsic characteristics they are grouped in several families one of which is the subfamily Enhancer of RNA interference-1 (ERI-1). Proteins of this group are 3’-5’ exoribonucleases belonging to the larger family of DEDDh nucleases in which the bacterial oligoribonuclease and RNase T are also members. ERI-1, a protein conserved in eukaryotes from the nematode to mouse, humans, drosophila, fission yeast and plants participates in various processes. These include degradation of siRNAs thus acting as suppressors of RNAi 3’ end trimming of the short 5.8S rRNA and degradation of histone mRNA. Arabidopsis thaliana Eri-1 homologue (ERI-1-Like-1, ERIL1) is targeted to the chloroplast. Nicotiana benthamiana transgenic lines overexpressing AtERIL1 present chlorotic phenotypes with abnormal plastid anatomy which resemble proplastids. Molecular analysis of these transgenic lines revealed low levels of chloroplasrtic transcripts compared to wild type plants. Aim of this work was to further study the role of Eri-1 plant homologue in the model plants A. thaliana and N. benthamiana. Initially, and due to the presence in N. benthamiana of two genetic loci coding for ERIL1, sequencing of the different transcripts was conducted which revealed that two differentially spliced forms arise from one of the two paralogue loci. In order to investigate the role of alternative splicing in subcellular localization of the protein, the genetic locus was fused to the reporter gene Green Fluorescent Protein and the construct was overexpressed in N. benthamiana leaves. Confocal analysis on protoplasts prepared from these tissues revealed its chloroplastic localization. The above result was also verified by western blot of chloroplastic extracts using an ERIL1 specific antibody. Next, the transgenic lines of both model plants with reduced expression levels where characterized by northern and western blot. The suppression lines had reduced chlorophyll content while transmission electron microscopy on leaf section from these N.benthamiana lines revealed abnormal chloroplast anatomy compared to wild type plants. In order to investigate a probable impact of ERIL1 on the chloroplast transcriptome, northern analysis was conducted from total RNA extracted from lines that overexpress and suppress ERIL1. The analysis showed a pronounced effect on the ribosomal RNAs suggesting an impact on the maturation process of these transcripts. Additionally to the above, immunoprecipitaion assays implied a role of ERIL1 also on some other chloroplastic transcripts. Transient overexpression of ERIL1 on fully expanded leaves followed by northern blot analysis revealed a role in the degradation of chloroplastic 4.5S rRNA. Lastly, the role of ERIL1 on RNA silencing was studied. From these experiments no apparent impact of ERIL1 in the accumulation of exogenous and viroid derived siRNAs could be concluded with the exception of specific miRNAs which overaccumulated in the transgenic plants that overexpressed the transgene. Altogether it can be concluded that ERIL1 participates in the maturation of the chloroplastic ribosomal RNAs and in the degradation of 4.5S rRNA while it has no effect on the RNA silencing pathways studied in this work.

Οι ριβονουκλεάσες αποτελούν μια ομάδα ενζύμων που συμμετέχουν σε μια πληθώρα διαδικασιών σε όλους τους οργανισμούς από τους ιούς έως τους ανώτερους ευκαρυώτες. Η λήξη της μεταγραφής, η ωρίμανση και επιδιόρθωση των μεταγράφων αλλά και ο μηχανισμός της RNA σίγησης αποτελούν μερικά από τα μονοπάτια στα οποία προεξέχοντα ρόλο επιτελεί αυτή η ομάδα ενζύμων. Ανάλογα με τη θέση δράσης τους πάνω στο υπόστρωμα αλλά και κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους κατηγοριοποιούνται σε διάφορες οικογένειες μεταξύ των οποίων είναι και η υποοικογένεια Enhancer of RNA interference-1 (ERI-1). Οι πρωτεΐνες τη ομάδας αυτής είναι 3’-5’ εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των DEDDh νουκλεασών, στην οποία μεταξύ άλλων ανήκουν και οι βακτηριακές ολιγοριβονουκλεάση και RNase T. Οι Eri-1 πρωτεΐνες είναι συντηρημένες στους ευκαρυώτες στους οποίους δρα ο μηχανισμός της RNA σίγησης, από το νηματώδη σκώληκα έως το ποντίκι, τον άνθρωπο, τη δροσόφιλα, τον Schizosaccharomyces pombe αλλά και τα φυτά. Συμμετέχουν σε διάφορες διαδικασίες όπως είναι η αποικοδόμηση των μικρών παρεμβαλλόμενων RNA (siRNA), δρώντας κατά αυτόν τον τρόπο στο μονοπάτι της RNA σίγησης, η ωρίμανση και αποικοδόμηση των ιστονικών μεταγράφων αλλά και η ωρίμανση του 5.8S ριβοσωμικού RNA. Το Eri-1 ομόλογο (ERI-1-Like-1, ERIL1) του φυτού Arabidopsis thaliana έχει χλωροπλαστιδιακή στόχευση ενώ φυτά Nicotiana benthamiana που υπερεκφράζουν το διαγονίδιο παρουσιάζουν χλωρωτικούς φαινοτύπους, με χλωροπλάστες που μοιάζουν προπλαστίδια . Από μοριακή ανάλυση των διαγονιδιακών αυτών σειρών προέκυψε ότι τα χλωροπλαστιδιακά μετάγραφα παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη της δράσης του Eri-1 ομολόγου στα φυτά (ERI-1-Like-1, ERIL) και συγκεκριμένα στα φυτά-μοντέλα Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana. Αρχικά, και λόγω της παρουσίας δύο παραλόγων γονιδίων στο είδος N. benthamiana, κλωνοποιήθηκαν τα μετάγραφα όπου και διαπιστώθηκε ότι από το ένα παράλογο γονίδιο προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δύο ισομορφές. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του εναλλακτικού ματίσματος στον ενδοκυττάριο εντοπισμό της παραγόμενης πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης της συγκεκριμένης γονιδιακής θέσης συντηγμένης με την πρωτεΐνη αναφοράς Green Fluorescent Protein, όπου με συνεστιακή μικροσκοπία διαπιστώθηκε ο χλωροπλαστιδιακός εντοπισμός. Η χλωροπλαστιδιακή στόχευση της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε και με ανάλυση τύπου western σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χλωροπλαστών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός των σειρών που παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης με αναλύσεις τύπου northern και western. Αυτές οι σειρές μαζί με σειρές υπερέκφρασης του διαγονιδίου οι οποίες είχαν χαρακτηριστεί από προηγούμενες μελέτες αποτέλεσαν τα εργαλεία για τη μελέτη της δράσης της υπό μελέτης πρωτεΐνης. Οι σειρές με έντονη καταστολή παρουσίαζαν μειωμένα επίπεδα χλωροφυλλών σε σχέση με φυτά αγρίου τύπου ενώ από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε τομές φύλλων φυτών N.benthamiana με καταστολή των ERIL1 γονιδίων διαπιστώθηκαν ότι οι χλωροπλάστες παρουσίαζαν παρεκκλίνουσα ανατομία. Από μοριακή ανάλυση τύπου northern φυτών με καταστολή και υπερέκφραση του ERIL1 διαπιστώθηκαν παρεκκλίνοντα πρότυπα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών μεταγράφων του χλωροπλάστη υποδεικνύοντας τη συμμετοχή της πρωτεΐνης στην ωρίμανση αυτών των μεταγράφων. Επιπλέον, με ανοσοκατακρήμνιση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη συγκατακρημνίζεται εκτός των ριβοσωμικών μεταγράφων και με ορισμένα άλλα χλωροπλαστιδιακά νουκλεϊκά οξέα υποδεικνύοντας κάποιο πιθανό ρόλο στην ωρίμανση αυτών. Τέλος, με παροδική υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε αναπτυγμένα φύλλα N. benthamiana παρατηρήθηκε επίδραση της στην αποικοδόμηση του ώριμου 4.5S rRNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της υπό μελέτης πρωτεΐνης στο μηχανισμό της RNA σίγησης. Από αυτά δεν διαπιστώθηκε κάποια επίδραση στο μονοπάτια που μελετήθηκαν, ενώ μόνο τα φυτά που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα συγκεκριμένων miRNA. Συνολικά, από τα πειράματα της παρούσας μελέτης συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη ERIL1 δρα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών χλωροπλαστιδιακών μεταγράφων και στην αποικοδόμηση του 4.5S rRNA ενώ δεν φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στα μονοπάτια της RNA σίγησης που μελετήθηκαν.