Ανάλυση, απομόνωση και έλεγχος των βιολογικών δράσεων λιπιδιακών ουσιών του φυτού Viscum album L. σε διάφορα μοντέλα καρκίνου

Abstract

Viscum album L. is a hemiparasitic plant known for centuries for itstherapeutic properties. In 1917 it was first used in the treatment of cancer and sincethen several studies have been conducted on the antitumor activity of the plantextracts and the plant proteins (lectins and viscotoxins). The anticancer activity of theplant is influenced by various factors, such as seasonal variations. Many studiesindicate that the anticancer effect of the plant is not entirely based on the existence oflectins and viscotoxins, but there are other low molecular weight components withhigh cytotoxic activities too. However, few studies have been conducted for the lowmolecular weight components of the plant.In the present thesis, the lipid fractions of the plant Viscum album ssp. abietiswere isolated during two different harvesting times, the winter (December-January)and the summer (June-July) time according to the methods proposed by Bligh-Dyerand Galanos-Kapoulas. The cytotoxic activities of these fractions were evaluated viathe MTT assay using the breast cancer cell line MCF-7 and the human embryonicfibroblasts MRC-5 as physiological control cell line. The lipids of the extractedfraction with the highest anticancer properties were separated by thin layerchromatography (TLC) and quantified using the Dichromate-Oxidizing method. Theircytotoxic properties were studied via the MTT assay, using the cell lines MCF-7 andMRC-5. The lipid component with the highest antitumor properties and the lesscytotoxic activities in normal cells was identified using the HPLC and ESI-MSmethods.The dose-dependent and the time-dependent antitumor effect of this substancewere studied in LMS, MCF-7, U2OS, HeLa and MRC-5 cell lines via the MTT andTrypan blue methods. In addition, the ability of colony efficiency capacity in LMSand MCF-7 cancer cells after incubation with increasing concentrations of the isolatedlipid was determined. The cell death mechanism caused by the isolated lipidcomponent of the plant was investigated with DNA electrophoresis in agarose using the LMS, MCF-7 and MRC-5 cell lines, as well as by flow cytometry using the cancercell line MCF-7.Furthermore, the inhibitory effect of the isolated component in human plateletaggregation was tested, ex vivo, using ADP and PAF as stimulators. The in vivo toxicactivity of the lipid component was studied in Wistar rats, using the models of acuteand chronic toxicity and the in vivo antitumor effect was studied in Wistar rats afterchallenge malignant neoplasia by inoculating LMS tumor cells.According to our results, the extraction procedure allowed us to obtain fourfractions. The chloroform phase (fraction 1) of the Bligh and Dyer extraction containsthe lipids and the water/methanol phase (fraction 2) contains more polar substances.Moreover, the distribution of the lipids by the Galanos - Kapoulas method led us toseparate the chloroform phase in two other fractions. The ether fraction (fraction 4),which contains the less polar lipids, including sterols, terpenes, hydrocarbons etc, andthe ethanol fraction (fraction 3) which contains the more polar lipids includingphospholipids and free fatty acids.The cytotoxic activity of the chloroform fraction (fraction 1) on MCF-7 breastcancer cells was higher compared to the water/methanol phase (fraction 2). Inaddition, the cytotoxic activity was higher in the leaves selected in the winterharvesting time. The ethanol fraction (fraction 3) was less cytotoxic on MCF-7 breastcancer cells compared to the neutral ether fraction 4, whose cytotoxicity was elevatedin the winter time of harvesting. All the fractions were less cytotoxic on thephysiological cell line MRC-5 (Table 1). The ether neutral lipid fraction showed higher cytotoxic activitiy compared tothe more polar fractions and was further analyzed with Thin Layer Chromatography.TLC revealed six zones (zones I, II, III, V, VI, VIII) during the summer harvestingtime and eight zones (zones Ib, IIb, IIIb, IVb, Vb, VIb, VIIb, VIIIb) during the wintertime of harvest. It was observed that zones IVb and VIIb (and thus the relevant lipids)of the winter fraction had not appeared in the summer fraction. The quantities of thelipids during both seasons were estimated using the Dichromate Oxidizing method. Aswas observed, the quantities of lipid components during the summer period werelower than those in winter. The lipid components of zone VI had the lowest quantityduring both seasons while the lipid II and V were found in larger quantities during thesummer period and lipid ΙΙb during the winter period.The cytotoxic activity of the lipid components of the hydrophobic etherfraction were evaluated using the MTT assay. According to our results, the inhibitoryactivity on the cancer cell proliferation during the winter harvesting time was highercompared to the lipid constituents of the summer time of harvest. Lipid IVb was themost cytotoxic on tumor cell line MCF-7 and the physiological cell line MRC-5 withIC50 values 0,065±0,024mg/ml and 0,088±0,036mg/ml respectively. The lipid Vbexhibited higher cytotoxic activities on MCF-7 cells compared to MRC-5 cells withIC50 values 0,160±0,017mg/ml and 0,556±0,027mg/ml respectively.The cell death mechanism caused by the isolated lipid component Vb of theplant was investigated with DNA electrophoresis in agarose using the breast cancercell line MCF-7. Our results indicated the presence of DNA fragments and revealedthat the lipid Vb leads the cells to death through the apoptotic mechanism.Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) andElectrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) showed that the lipidcomponent Vb is a diterpene, probably having molecular formula C20H32O2 orC20H33O2 and its molecular weight is either 304,2 or 305. These data revealed that theisolated unknown diterpene is a structure analogue of the diterpene sclareol. Sclareolis a labdane diterpene having the molecular formula C20H36O2 and a molecular weightof 308,5.Due to financial reasons, we decided to perform the following experimentalprocedures with the diterpene sclareol, commercially available. The antitumor activity of sclareol was studied on LMS, MCF-7, U2OS, HeLaand MRC-5 cell lines via the MTT and Trypan blue methods. According to bothmethods, sclareol inhibited the cell proliferation of all the tested tumor cell lines in adose-dependent and time-dependent manner, while it was less cytotoxic in normalfibroblasts (Table 2). As was observed, sclareol has the ability to induce DNA damage to the celllines LMS, MCF-7 and MRC-5 in a dose-dependent manner and leads to apoptoticcell death. Moreover, sclareol inhibits colony forming ability and causes permanentdamage to the cancer cell lines LMS and MCF-7 in a dose-dependent manner.The ex vivo experimental procedures showed that sclareol does not stimulatethe platelet aggregation. Instead, sclareol inhibits the platelet aggregation afteractivation by the stimulators ADP and PAF, in a dose-dependent manner.The results obtained from the acute toxicity showed that sclareol had noobvious toxic effect on the experimental animals even at high concentrations.Administration of concentrations higher than 400 mg/kg of sclareol causeshistological signs of pulmonary edema initiation in experimental animals, but thiscondition might be an artifact derived from the diethyl ether action during sacrifice ofanimals. Side effects such as inability to move, difficulties in breathing andgeneralized neuromuscular depression were observed only at the highestconcentrations that were used. It is important to note that within 24 hours theexperimental animals returned to their physiological condition. According to our data obtained from the chronic toxicity, sclareol does notcause death to the experimental animals and the LD50 of sclareol is higher than 5g/kg.Moreover, the gradual administration of high concentrations of sclareol does notdamage or alter the vital organs of the animals.The tumor-bearing animals that were treated with the highest concentration ofsclareol were more energetic than the other groups. Food intake and fecal excretionwas physiological and stable in all the experimental groups. The water intake andurine output was physiological, except the second treatment group, where astatistically significant increased water uptake and urinary excretion was observed.The growth rate of the tumor weight and the average weight of the tumor washigher in the control group compared with the two treatment groups. In addition, theaverage lifetime of the treatment animals was higher than the control group. At theend of the experimental procedure, 47% of the animals of the second treatment groupwhich were survived sacrificed. Higher inhibition of tumor growth was observed inthe first treatment group. Moreover, sclareol does not damage or alter the vital organsof the animals, while the 26% of the animals of the control group exhibited lungmetastasis.According to the above, the anticancer activity and the amount of the lowmolecular weight lipid constituents of the plant Viscum album depend on the time ofharvesting. These results indicate that the adaptation mechanisms of the plant toprolonged cold invernal stress play an important role in its anticancer activity.In addition, the diterpene sclareol, the structural analogue of the isolated lipidcomponent of the plant Viscum album, exhibited high antitumor activities in all thecancer cell lines that were studied in vitro and provided promising outcomes in vivo.Since the anticancer drugs that are used nowadays cause various side effects due totheir toxicity in the human body and the fact that they are costly, sclareol could be aneffective antitumor agent. Due to its low toxicity and its low cost, it has substantialadvantages if used as an anticancer drug. Moreover it is important to note that from afinancial point of view, sclareol is a very competitive substance since it is found inabundance in nature.

Το Viscum album είναι ένα παρασιτικό φυτό γνωστό από την αρχαιότητα γιατις θεραπευτικές του ιδιότητες. Το 1917 χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στηθεραπεία του καρκίνου και έκτοτε αρκετές μελέτες έχουν γίνει για την αντικαρκινικήδράση του εκχυλίσματος του αλλά και των πρωτεϊνών του (λεκτίνες καιβισκοτοξίνες), η οποία επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως οι εποχικέςδιακυμάνσεις. Πολλές μελέτες αναφέρουν ότι η αντικαρκινική δράση του φυτού δενβασίζεται εξ ολοκλήρου στην ύπαρξη των λεκτινών και των βισκοτοξινών, αλλάυπάρχουν και άλλα μόρια, χαμηλού μοριακού βάρους, τα οποία δρουν επίσηςκυτταροτοξικά. Παρόλα αυτά, ελάχιστες έρευνες έχουν γίνει για τα συστατικάχαμηλού μοριακού βάρους του φυτού.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή απομονώθηκαν τα λιπιδιακά κλάσματατου φυτού Viscum album ssp. abietis κατά τη διάρκεια δύο διαφορετικών εποχώνσυγκομιδής, της χειμερινής (Δεκέμβριος-Ιανουάριος) και της καλοκαιρινής (Ιούνιος-Ιούλιος) περιόδου σύμφωνα με τις μεθόδους Bligh-Dyer και Galanos-Kapoulas καικατόπιν μελετήθηκε η κυτταροτοξική τους δράση στις κυτταρικές σειρές MCF-7 καιMRC-5 με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Το κλάσμα που εμφάνισε την ισχυρότερηκυτταροτοξική δράση κατά τη διάρκεια και των δύο εποχών, αναλύθηκε περαιτέρωμε χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Κατόπιν πραγματοποιήθηκε ποσοτικόςπροσδιορισμός των λιπιδιακών συστατικών που απομονώθηκαν μέσω οξείδωσης μεδιχρωμικό άλας και έπειτα μελετήθηκε η κυτταροτοξική δράση τους στις κυτταρικέςσειρές MCF-7 και MRC-5 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΜΤΤ. Ο έλεγχος τουμηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που προκαλεί το λιπιδιακό συστατικό με τηνισχυρότερη κυτταροτοξική δράση στα καρκινικά κύτταρα και την ασθενέστερηδράση στα φυσιολογικά κύτταρα μελετήθηκε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησηςDNA σε πήκτωμα αγαρόζης. Έπειτα αυτό το λιπιδιακό συστατικό ταυτοποιήθηκε μετη μέθοδο της Υψηλής Ανάλυσης Υγρής Χρωματογραφίας Ανάστροφης Φάσης (RP-HPLC) και την τεχνική της Φασματοσκοπίας Μάζας μέσω ιονισμού μεηλεκτροψεκασμό (ESI-MS).Η δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη αντικαρκινική δράση της δομικάανάλογης ουσίας του συστατικού αυτού μελετήθηκε περαιτέρω στις κυτταρικέςσειρές LMS, MCF-7, U2OS, HeLa και MRC-5 με τις μεθόδους ΜΤΤ και Trypanblue. Επίσης μελετήθηκε η ικανότητα ανάπτυξης αποικιών των νεοπλασματικώνκυττάρων LMS και MCF-7 έπειτα από επώαση τους με αυξανόμενες συγκεντρώσειςτου συστατικού αυτού. Ο μηχανισμός θανάτου που προκαλεί η ουσία στα κύτταραμελετήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης DNA σε πήκτωμα αγαρόζης στιςκυτταρικές σειρές LMS, MCF-7 και MRC-5, καθώς επίσης και μέσω κυτταρομετρίαςροής χρησιμοποιώντας την καρκινική κυτταρική σειρά MCF-7. Επιπλέον ελέγχτηκε ηανασταλτική δράση της ουσίας αυτής στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων τουανθρώπου ex vivo. Ακολούθησε έλεγχος της τοξικής δράσης του λιπιδιακούσυστατικού σε επίμυες Wistar μέσω των μοντέλων οξείας και χρόνιας τοξικότηταςκαι έπειτα μελετήθηκε η αντικαρκινική δράση του σε καρκινοπαθείς επίμυες Wistarέπειτα από πρόκληση κακοήθους νεοπλασίας μέσω ενοφθαλμισμούλειομυοσαρκωματικών κυττάρων LMS.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το λιπιδιακό κλάσμα του φυτού με τηνισχυρότερη κυτταροτοξική δράση είναι το αιθερικό κλάσμα, το οποίο περιέχει όλα ταουδέτερα λιπίδια του φυτού (τερπένια, υδρογονάνθρακες, στερόλες). Ηχρωματογραφία λεπτής στιβάδας αποκάλυψε την ύπαρξη 6 κοινών λιπιδιακώνσυστατικών κατά την καλοκαιρινή και χειμερινή εποχή συγκομιδής και 2 επιπλέονλιπιδιακών συστατικών κατά την χειμερινή εποχή συγκομιδής. Οι συγκεντρώσεις τωνλιπιδιακών συστατικών που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια και των 2 εποχώνσυγκομιδής παρατηρείται ότι διαφέρουν και εμφανίζονται αυξημένες κατά τηδιάρκεια του χειμώνα. Επίσης η κυτταροτοξική δράση των λιπιδιακών συστατικώνείναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια της χειμερινής περιόδου. Το λιπιδιακό συστατικόμε την ισχυρότερη κυτταροτοξική δράση στα καρκινικά κύτταρα και τηνασθενέστερη δράση στα φυσιολογικά κύτταρα απομονώθηκε κατά τη διάρκεια τηςχειμερινής εποχής συγκομιδής. Η ταυτοποίηση του συστατικού αυτού έδειξε ότιπρόκειται για ένα διτερπένιο, δομικά ανάλογο της σκλαρεόλης Η σκλαρεόλη προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω του μηχανισμού τηςαπόπτωσης με δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο και οι βλάβες πουπροκαλεί στα καρκινικά κύτταρα είναι μη αναστρέψιμες. Επίσης η σκλαρεόληπροκαλεί αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων η οποία αυξάνεται σεαυξανόμενες συγκεντρώσεις της ex vivo.Οι in vivo μελέτες έδειξαν ότι η σκλαρεόλη δεν προκαλεί θάνατο σε επίμυεςWistar, ακόμα και σε πολύ μεγάλες συγκεντρώσεις (LD50>5g/kg). Η άμεση χορήγησημεγάλων συγκεντρώσεων της προκαλεί πνευμονικό οίδημα, αντιθέτως η σταδιακήχορήγηση της σκλαρεόλης, ακόμα και πολύ μεγάλων συγκεντρώσεων, δεν προκαλείβλάβη στα όργανα των πειραματόζωων. Οι παρενέργειες που προκαλεί σταπειραματόζωα έπειτα από χορήγηση μεγάλων συγκεντρώσεων της είναι δυσκινησία,καταστολή και δυσκολία στην αναπνοή, τα οποία επανέρχονται έπειτα από 24 ώρεςστη φυσιολογική τους κατάσταση. Επιπλέον μειώνει το μέγεθος του όγκουκαρκινοπαθών επίμυων Wistar κατά ένα μικρό ποσοστό (16%) ενώ αυξάνει τον χρόνοεπιβίωσης τους κατά 35% σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, αποδεικνύεται ότι το χαμηλού μοριακούβάρους διτερπένιο που απομονώθηκε από το φυτό, εμφανίζει αντικαρκινική δράση ηοποία εξαρτάται από την εποχή συγκομιδής του φυτού. Επίσης η σκλαρεόλη, ηδομικά ανάλογη ουσία του συστατικού αυτού, φέρει ισχυρή κυτταροτοξική δράση invitro. Λόγω της χαμηλής τοξικότητας που εμφανίζει και τον ήπιων παρενεργειών πουπροκαλεί in vivo, αποτελεί ένα συστατικό ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, το οποίομελλοντικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας νέος αντινεοπλασματικόςπαράγοντας.