Studies on the role of aminoacyl-tRNA synthesis in the regulation of ribosomal and exo-ribosomal protein synthesis in pathogens

Abstract

During the flow of the genetic information, tRNA molecules hold a central position as adaptors between nucleic acids and proteins. Although until recently it was believed that tRNAs act only as passive carriers of amino acids, recent discoveries brought them into spotlight as essential regulators of transcription and translation. It has been recently established that the functional role of tRNA molecules extends beyond their core cellular role in translation. This notion triggered a new point of view of tRNAs and established their involvement in gene expression regulation. The parallel identification of an important riboswitch class which is highly distributed among bacterial organisms (mostly in pathogens), termed T-boxes, confirmed the ability of tRNAs to control essential metabolic pathways. T-box riboswitches are found in the 5’UTR of mRNAs and can utilize either charged or uncharged tRNA molecules as ligands in order to control the expression of enzymes involved in amino acid biosynthesis and aminoacyl-tRNA synthesis. It is known that T-boxes can regulate downstream gene transcription by adopting two alternative conformations termed "terminator" and "antiterminator”. The uncharged tRNA which is initially recognized by the specifier loop in stem I region through codon-anticodon complementarity, stabilizes the antiterminator conformation and as a consequence allows the transcription “read-through” of the downstream gene or operon. In staphylococci, a T-box riboswitch precedes the glyS gene encoding glycyl-tRNA synthetase (GlyRS). GlyRS mediates the formation of the Gly-tRNAGly molecules that serve as substrates for the protein synthesis and for the exo-ribosomal glycine-mediated stabilization of the bacterial cell wall. Previous work of our group revealed that in S. aureus there are two encoded proteinogenic tRNAGly isoacceptors [P1(GCC) and P2(UCC)] and three non-proteinogenic tRNAGly isoacceptors [NP1(UCC), NP2(UCC) and NEW(UCC)] with extra-translational roles which bind poorly to EF-Tu. In the present study, we tried to unravel and verify both the glyS T-box structure and the differential utilization of tRNAGly isoacceptors either in protein synthesis or cell wall formation. Extended bioinformatic and biochemical analyses revealed the existence of a functional T-box regulatory element upstream the glyS gene albeit with divergent structural features in comparison with other known glyQS T-boxes. The most intriguing structural feature identified is the additional 42 nt long intervening sequence, termed stem Sa, which is present in both terminator and antiterminator conformations and moreover, seems to be staphylococci-specific. In vitro binding and transcription readthrough experiments revealed that this T-box riboswitch can utilize both proteinogenic and non-proteinogenic tRNAGly isoacceptors through specifier’s codon unconventional reading. Moreover, in vivo readthrough experiments confirmed this ambiguity and verified the proposed species-specific regulatory mechanism. Additional in vivo data suggested that all tRNAGly isoacceptor presence is essential for growth and viability. In conclusion, specific utilization of different tRNAGly isoacceptor during pathogen’s life contributes both in regulation and synchronization of ribosomal and exo-ribosomal peptide synthesis in a species-specific context. However, the exact regulatory mechanisms that occur during pathogens’s metabolic adaptation and infection require further experimentation. Finally, this study gives for the first time evidence to the existence of an elegant mechanism that synchronizes essential metabolic pathways in pathogens and moreover can be used as an alternative to the current therapy target for the development of novel antimicrobial drugs. In conclusion, the present thesis contributes towards the elucidation of the regulatory role of tRNA molecules, expands our current knowledge on the structure and function of regulatory RNAs in bacteria and underlines the impressive complexity of networks and components of translation during regulation of the flow of the genetic information.

Τα μόρια tRNA αποτελούν τους βασικούς προσαρμογείς του γενετικού κώδικα στην γλώσσα των αμινοξέων. Μέχρι πρόσφατα ο κύριος ρόλος τους φαινόταν να περιορίζεται στην συνεισφορά τους ως υποστρώματα της πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής αν και η συμβολή τους στην εξέλιξη είναι καθοριστική. Παρόλα αυτά πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα μόρια tRNA εκτός της βασικής λειτουργίας που επιτελούν στην πρωτεϊνική σύνθεση, δηλαδή αυτής της μεταφοράς αμινοξέων, παρουσιάζουν και επιπρόσθετες λειτουργιές που αφορούν στη συμμέτοχη τους σε άλλες σημαντικές κυτταρικές διαδικασίες όπως είναι η ρύθμιση της μεταγραφής και της μετάφρασης. Οι καινούριες αυτές λειτουργίες των μορίων tRNA ανέδειξαν μια διαφορετική προσέγγιση του ρόλου τους μέσα στο κύτταρο, καθορίζοντάς τα ως ρυθμιστικούς τελεστές της γονιδιακής έκφρασης. Παράλληλα η ανακάλυψη μιας σημαντικής κατηγορίας ρυθμιστικών στοιχείων της γονιδιακής έκφρασης, γνωστά ως Τ-box ριβοδιακόπτες, επιβεβαίωσε την ικανότητα των μορίων tRNA να ελέγχουν σημαντικές μεταβολικές οδούς. Οι Τ-box ριβοδιακόπτες βρίσκονται στην 5' αμετάφραστη περιοχή των μορίων mRNA (5’UTR) και μπορούν να ελέγχουν την έκφραση των υπό-ρύθμιση γονιδίων τους αλληλεπιδρώντας τόσο με αμινοακυλιωμένα όσο και με μη-αμινοακυλιωμένα μόρια tRNA. Αυτού του τύπου τα ρυθμιστικά στοιχεία βρίσκονται ευρέως διαδεδομένα σε προκαρυωτικούς οργανισμούς αλλά ειδικότερα σε παθογόνα βακτήρια. Επιπρόσθετα τα γονίδια τα οποία υπόκεινται σε μεταγραφικό έλεγχο από τους Τ-box ριβοδιακόπτες κωδικοποιούν κυρίως ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στη βιοσύνθεση αμινοξέων και στην αμιναακυλίωση των μορίων tRNA (αμινοακυλο-tRNA συνθετάσες). Η αποκάλυψη της λειτουργίας των Τ-box ριβοδιακοπτών ανέδειξε την ύπαρξη ενός ρυθμιστικού μηχανισμού σε μεταγραφικό επίπεδο, όπου η ίδια η αλληλουχία του RNA μπορεί να εναλλάσσεται μεταξύ δύο διαφορετικών διαμορφώσεων χωρίς τη συμμετοχή κάποιου πρωτεϊνικού παράγοντα και ως αποτέλεσμα, να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση. Αυτές οι εναλλακτικές διαμορφώσεις αποτελούνται από δύο χαρακτηριστικές ελικοειδείς διαμορφώσεις οι οποίες ονομάζονται βρόχος τερματισμού (terminator) και βρόχος αντί-τερματισμού της μεταγραφής (antiterminator). Ο βρόχος τερματισμού αποτελεί τη θερμοδυναμικά ευνοούμενη διαμόρφωση απουσία του tRNA-προσδέτη ενώ ο βρόχος αντί-τερματισμού χρειάζεται την παρουσία μη-αμινοακυλιωμένου tRNA για να σταθεροποιηθεί. Αλληλεπίδραση του μορίου tRNA με μια εξειδικευμένη δομική περιοχή του ριβοδιακόπτη, που ονομάζεται θηλιά εξειδίκευσης (specifier loop), μέσω συμπληρωματικότητας τύπου κωδικωνίου-αντικωδικονίου μπορεί να σταθεροποιήσει τη δομή αντί-τερματισμού εφόσον το μόριο tRNA βρίσκεται στη μη-αμινοακυλιωμένη του μορφή και κατά συνέπεια να επάγει τη μεταγραφή του υπό-ρύθμιση γονιδίου ή οπερονίου. Στο παθογόνο Staphylococcus, ένα τέτοιο ρυθμιστικό στοιχείο Τ-box βρίσκεται ανοδικά του γονιδίου που κωδικοποιεί την αμινοάκυλο-tRNA συνθετάση της γλυκίνης (GlyRS). Η GlyRS μεσολαβεί το σχηματισμό αμινοακυλιωμένων μορίων Gly-tRNAGly και ακολούθως τα συγκεκριμένα μόρια αποτελούν υποστρώματα τόσο της πρωτεϊνικής σύνθεσης όσο και τη σύνθεσης πενταπεπτιδίων γλυκίνης η οποία καταλύεται από την οικογένεια των μη-ριβοσωμικών πεπτιδυλ-τρανσφερασών (FemXAB). Τα ένζυμα αυτά συμβάλλουν στη σταθεροποίηση της τρισδιάστατης δομής του κυτταρικού τοιχώματος. Προηγούμενη εργασία της ερευνητικής μας ομάδας αποκάλυψε την ύπαρξη πέντε διαφορετικών ισοδεκτικών μορίων tRNAGly στον S. aureus τα οποία μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει δύο πρωτεϊνογενετικά ισοδεκτικά μόρια tRNAGly [Ρ1 (GCC) και P2 (UCC)], τα οποία αλληλεπιδρούν ισχυρά με τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-Tu και συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, ενώ η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τρία μη-πρωτεϊνογενετικά ισοδεκτικά μόρια [NP1 (UCC), ΝΡ2 (UCC) και NEW (UCC)], τα οποία αλληλεπιδρούν ασθενώς με τον EF-Tu και συμμετέχουν στη έξω-ριβοσωμική πρωτεϊνική σύνθεση που λαμβάνει χώρα στη τελική διαμόρφωση του κυτταρικού τοιχώματος. Η παρούσα μελέτη έχει ως σκοπό αρχικά τον βιοχημικό χαρακτηρισμό των υποστρωμάτων της GlyRS και ακολούθως την διερεύνηση και αποσαφήνιση της δομής του ρυθμιστικού στοιχείου T-box που βρίσκεται ανοδικά του γονιδίου glyS στο παθογόνο S. aureus. Επιπλέον η μελέτη επεκτάθηκε και στη διερεύνηση της διαφορικής χρήσης τόσο των πρωτεϊνογενετικών όσο και των μη-πρωτεϊνογενετικών ισοδεκτικών μορίων tRNAGly στην πρωτεϊνική σύνθεση και στο σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος. Η ανάλυση έδειξε ότι ανάμεσα σε συγγενή είδη σταφυλόκοκκων και παρά την σημαντική συντήρηση τόσο της δομής της GlyRS όσο και των στοιχείων ταυτότητας των ομόλογων μορίων tRNAGly παρατηρήθηκε διαφοροποίηση ως προς τα επίπεδα αμινοακυλίωσης. Ακολούθως, λεπτομερής βιοπληροφορική και βιοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε την ύπαρξη ενός λειτουργικού ρυθμιστικού στοιχείου Τ-box ανοδικά του γονιδίου glyS, αλλά με την ύπαρξη επιμέρους δομικών χαρακτηριστικών που διαφέρουν σε σύγκριση με άλλες γνωστές δομές που έχουν αποκαλυφθεί για αντίστοιχα ρυθμιστικά στοιχεία σε άλλους οργανισμούς. Ο συγκεκριμένος ριβοδιακόπτης περιλαμβάνει ένα χαρακτηριστικό δομικό στοιχείο το οποίο αποτελείται από μια επιπρόσθετη αλληλουχία μήκους 42 νουκλεοτιδίων, το οποίο και ονομάστηκε stem Sa (βρόχος Sa, από τα αρχικά Staphylococcus aureus). Το stem Sa συμμετέχει τόσο στη διαμόρφωση του βρόχου τερματισμού όσο και στη διαμόρφωση του βρόχου αντί-τερματισμού της μεταγραφής. Επιπρόσθετα, το συγκεκριμένο στοιχείο αποτελεί μοναδικό δομικό χαρακτηριστικό αυτού του τύπου ριβοδιακόπτη (glyS T-box) και εμφανίζεται συντηρημένο μόνο σε στελέχη σταφυλόκοκκων και σε κανένα άλλο βακτήριο. In vitro μελέτη της δευτεροταγούς διαμόρφωσης συμπλόκων ριβοδιακόπτη:tRNA, όσο και επαγωγής της μεταγραφής έδειξαν ότι ο συγκεκριμένος T-box ριβοδιακόπτης μπορεί να χρησιμοποιεί τόσο τα πρωτεϊνογενετικά όσο και τα μη-πρωτεϊνογενετικά ισοδεκτικά μόρια tRNAGly, μέσω αντισυμβατικής ανάγνωσης του κωδικονίου της θηλιάς εξειδίκευσης, κάτι το οποίο αναφέρεται για πρώτη φορά στην διεθνή βιβλιογραφία. Παρόμοια αντίστοιχη αντισυμβατική ανάγνωση έχει αναφερθεί και στην αποκωδικοποίηση κωδικονίων γλυκίνης κατά την ριβοσωμική πρωτεϊνοσύνθεση, καθώς τόσο το GCC όσο και το UCC αντικωδικόνιο μπορεί να αναγνωριστεί από την ίδια κωδική τριπλέτα (GGC). Πειράματα in vivo επαγωγής της μεταγραφής επαλήθευσαν την προτεινόμενη αντισυμβατική αναγνώριση της τριπλέτας εξειδίκευσης και τη συμμετοχή διαφορετικών ισοδεκτικών μορίων tRNAGly στο συγκεκριμένο ρυθμιστικό μηχανισμό. Πρόσθετες in vivo πειραματικές διαδικασίες ανέδειξαν επίσης ότι η παρουσία όλων των ισοδεκτικών μορίων tRNAGly είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα του παθογόνου. Πιο συγκεκριμένα, επιβεβαιώθηκε ότι τα μη-πρωτεινογενετικά μόρια tRNA όντως συμμετέχουν ως υποστρώματα στην σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και επιπλέον, τόσο τα πρωτεϊνογενετικά όσο και τα μη-πρωτεϊνογενετικά μόρια tRNA μπορούν να ελέγχουν τα επίπεδα μεταγραφής της GlyRS in vivo σε διαφορετικά όμως επίπεδα. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή συμβάλει στην αποσαφήνιση του ρυθμιστικού ρόλου των μορίων tRNA σε δύο μεταβολικά ασύνδετες πορείες και αποτελεί το πρώτο παράδειγμα εξειδικευμένου δομικά ριβοδιακόπτη ανάμεσα στα είδη σταφυλοκόκκων. Η αρχική υπόθεση υποστηρίχθηκε από δεδομένα που δείχνουν διαφορική εξειδίκευση των ισοδεκτικών μορίων tRNAGly στη διάρκεια ζωής του παθογόνου η οποία συμβάλλει τόσο στη ρύθμιση και όσο και στο συγχρονισμό δυο ανεξάρτητων αλλά σημαντικών μεταβολικών μονοπατιών, της ριβοσωμικής και της έξω-ριβοσωμικής σύνθεσης και επιπλέον σε ένα πλαίσιο εξειδικευμένο για το συγκεκριμένο είδος παθογόνου. Ωστόσο οι ακριβείς ρυθμιστικοί μηχανισμοί που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της προσαρμογής του παθογόνου σε μεταβαλλόμενες συνθήκες περιβάλλοντος όσο και σε συνθήκες μόλυνσης του ξενιστή παραμένουν προς μελλοντική διερεύνηση και αποσαφήνιση. Τέλος η συγκεκριμένη μελέτη αναδεικνύει για πρώτη φορά την ύπαρξη ενός «λεπτού» μηχανισμού γονιδιακής έκφρασης που συγχρονίζει απαραίτητες για τη βιωσιμότητα του παθογόνου μεταβολικές οδούς. Επιπλέον η ανάδειξη της λειτουργίας του συγκεκριμένου ρυθμιστικού μηχανισμού τον καθιστά εναλλακτικό στόχο για την ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών φαρμάκων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως λύση έναντι της τρέχουσας θεραπείας για αυτού του είδους τα παθογόνα, η οποία φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την παρουσία ανθεκτικών στελεχών.