Βιοτεχνολογική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης, 2,3-βουτανοδιόλης και αιθανόλης κατά την αύξηση επιλεγμένων προκαρυωτικών στελεχών σε ανανεώσιμες πηγές άνθρακα

Abstract

The ability of bacterial strains to assimilate glycerol, the main by-product of biodieselproduction facilities, in order to generate higher value compounds of significance for the food andchemical industry, namely 1,3-propanediol (PD), 2,3-butanediol (BD) and ethanol (EtOH), wasassessed during the current thesis. Under this view, 84 bacterial strains were screened for theirability to metabolise crude glycerol, under different fermentation conditions. All but one of thetested strains (Clοstridium butyricum NRRL B-23495), were obtained from various collections ofthe Department of Food Science and Technology of the Agricultural University of Athens and weretested for the first time for their ability to assimilate glycerol. All of these strains were natural onesand were mostly isolated from foodstuffs, such as meat products, fermented sourdoughs andinfected grapes.The experimental procedure was divided in two parts: First, a preliminary assessment ofglycerol assimilation for all 84 strains was performed in batch-flask cultures using pure glycerol andglucose as co-substrates, at a 3:1 ratio. Pure glycerol was selected as substrate in order to avoidinhibition phenomena caused by the impurities, potentially found in crude glycerol feedstock.Glucose was added with the intention of facilitating microbial growth and consequently glycerolassimilation, by the tested strains. All 84 tested strains were able to grow in the mixture of glyceroland glucose, but only 16, amongst the screened strains, were capable of assimilating glycerol. These16 strains were further cultivated in batch-flask cultures using crude glycerol as substrate.On completion of the first part of the study, four strains, namely Citrobacter freundiiFMCC-B 294 (VK-19), C. freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197 and Enterobacteraerogenes FMCC-10, were chosen for further testing. Selection was based on glycerol consumptionand product formation of three main metabolites (1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol). Cl.butyricum NRLL B-23495, the strain obtained from the NRLL collection, was also found to havesatisfactory production of 1,3-propanediol (maximum 1.3-propanediol concentration 32.2 g/l andyield of 1.3-propanediol produced per glycerol consumed 0.58 g/g). However, this strain was usedprimarily as a basis for comparison of glycerol consumption and 1,3-propanediol production andthus was not studied further.During the second part of the experimental procedure, the production of 1,3-propanediol,2,3-butanediol and ethanol was studied, during cultivations of the four selected strains on biodieselderivedglycerol-based media. Feedstock origin, initial glycerol concentration and experimentalconditions (pH conditions, anaerobic/aerobic culture conditions, strategy of imposed anaerobiosis, etc) were found to have an important impact on the distribution of metabolic products. All fourstrains were able to assimilate elevated amounts of crude glycerol and a maximum consumption of~217.0 g/L was observed during fed-batch fermentation of E. aerogenes FMCC-10 strain, underaerobic conditions.The maximum 1,3-propanediol concentration (PDmax), 68.1 g/L, was achieved duringanaerobic fed-batch fermentation of C. freundii FMCC-B 294 (VK-19), with yield of 1,3-propanediol produced per glycerol consumed YPD/Gly=0.40 g/g and volumetric productivity 0.79g/L/h. Meanwhile, 50.1 g/ of 1.3-propanediol were produced through a fed-batch fermentation of K.oxytoca FMCC-197 strain, under self-generated anaerobiosis conditions. These are the highest PDconcentrations achieved by natural C. freundii and K. oxytoca strains so far and, in general, amongstthe highest ones using crude glycerol as substrate, reported in the international literature. To thebest of our knowledge, this is the first study dealing with the growth of K. oxytoca strain on rawglycerol.Concerning 2,3-butanediol, a maximum concentration (BDmax) of 78.2 g/L was obtainedduring an aerobic fed-batch fermentation of E. aerogenes FMCC-10. Aiming to maintain pHuncontrolled in slightly acetic conditions, but not below a critical value inhibitory for glycerolconsumption, the technique of pH-fluctuations was employed. According to this technique, afterevery feed during the fed-batch fermentation, the pH was increased to value 7.0 and remained uncontrolled.This allowed a natural acidification, necessary for 2,3-butanediol synthesis, and at thesame time in a pH area suitable for glycerol assimilation. To the best of our knowledge, it is the firsttime that 2.3-butanediol was synthesized as the principal metabolic product from crude glycerol; sofar it has been a by-product of the propanediolic fermentation. Thus, the concentration achieved isthe highest reported in literature so far. It is also remarkable that this concentration was obtainedunder aerobic conditions, while glycerol metabolism is mainly conducted under anaerobicconditions. Another interesting result achieved in the current thesis was the conversion of biodieselderivedcrude glycerol into ethanol in significant quantities (EtOHmax=33.4 g/L), during anaerobicfed-batch fermentations by C. freundii FMCC-207 strain. This value is, so far, the highest onereported in the international literature, by taking into consideration both natural and mutant strainsgrowing on glycerol. Equally high amounts were formed during feb-batch cultures by K. oxytocaFMCC-197 and E. aerogenes FMCC-10 strains (25.2 και 20.9 g/L, respectively).Finally, the feasibility of batch and fed-batch cultures under non-sterile conditions was alsoexamined and the absence of sterile cultivation conditions proved to have no considerable effectupon the efficiency of the fermentation in all cases. Compared to the results achieved under sterileconditions, trivial differences were detected on final product concentrations. The achieved resultsfrom all studies indicated that absence of sterile cultivation conditions may prove to be an interesting parameter for the industrial application of glycerol conversions by prokaryotic microbialstrains. The implementation of non-sterile conditions minimizes the energy cost for sterilization, aswell as the overall equipment cost. Together with the utilization of low-cost biodiesel-derived crudeglycerol as substrate, this implementation could make the microbial conversion of crude glycerol to1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol an economically competitive bioprocess.

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η ικανότητα 84 βακτηριακών στελεχών να μεταβολίσουντη βιομηχανική γλυκερόλη, κύριο παραπροϊόν της διαδικασίας παραγωγής βιολογικού πετρελαίου(βιοντίζελ), προς παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης (PD), 2,3-βουτανοδιόλης (BD) και αιθανόλης(EtOH), υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Τα εξεταζόμενα στελέχη ανήκουν, πλην ενός(Clοstridium butyricum NRRL B-23495), σε συλλογές του τμήματος Επιστήμης και ΤεχνολογίαςΤροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, είναι φυσικά στελέχη και μελετήθηκαν γιαπρώτη φορά ως προς τη δυνατότητα μεταβολισμού της γλυκερόλης. Στην πλειοψηφία τους έχουναπομονωθεί από τρόφιμα όπως προϊόντα κρέατος, προζύμι και καρπούς σταφυλήςπροσβεβλημένους από τον μύκητα Botrytis sp..Η πειραματική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο στάδια: Αρχικά διενεργήθηκαν ασυνεχείςκαλλιέργειες σε φιάλες, με την καθαρή γλυκερόλη και την γλυκόζη ως συνυποστρώματα σεαναλογία 3:1, είτε υπό αναερόβιες είτε υπό αερόβιες συνθήκες ανάλογα με τις απαιτήσεις σεοξυγόνο του εκάστοτε μικροοργανισμού. Η επιλογή της καθαρής γλυκερόλης έγινε με στόχο τηναποφυγή φαινομένων παρεμπόδισης εξαιτίας προσμίξεων που περιέχονται στην βιομηχανικήγλυκερόλη, ενώ η προσθήκη γλυκόζης στο μέσο της καλλιέργειας κρίθηκε σκόπιμη, καθώς τουπόστρωμα αυτό δύναται να ενισχύσει τη μικροβιακή αύξηση και ως εκ τούτου, ενδεχομένως, ναδιευκολύνει τον μεταβολισμό της γλυκερόλης από τα υπό μελέτη στελέχη. Από τα 84 στελέχη, ανκαι όλα παρουσίασαν κυτταρική αύξηση, μόνο 16 αφομοίωσαν την γλυκερόλη. Σε δεύτερηπροσέγγιση τα 16 αυτά στελέχη αναπτύχθηκαν σε ασυνεχείς καλλιέργειες σε φιάλες με πηγήάνθρακα την βιομηχανική γλυκερόλη. Αφού συνεκτιμήθηκε τόσο η κατανάλωση της γλυκερόληςόσο και η παραγωγή των τριών κύριων μεταβολιτών (1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόλη καιαιθανόλη), επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη τα ακόλουθα τέσσερα στελέχη: Citrobacter freundiiFMCC-B 294 (VK-19), C. freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197 και Enterobacteraerogenes FMCC-10. Σημειώνεται ότι παρά την ικανοποιητική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης απότο στέλεχος Cl. butyricum NRLL B-23495 στο αρχικό στάδιο της πειραματικής διαδικασίας(μέγιστη συγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης 32,2 g/L και συντελεστής απόδοσης παραγόμενης 1,3-προπανοδιόλης ανα καταναλωθείσα γλυκερόλη 0,58 g/g), δεν διενεργήθηκαν περαιτέρω μελέτες μετον εν λόγω μικροοργανισμό, δεδομένου ότι τα αποτελέσματα αυτών των καλλιεργειώναποτέλεσαν τη βάση σύγκρισης για την κατανάλωση γλυκερόλης και παραγωγή 1,3-προπανοδιόληςμε τα υπόλοιπα στελέχη.Στο δεύτερο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας διερευνήθηκαν καλλιέργειες τωντεσσάρων στελεχών, σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Μελετήθηκε ηεπίδραση διαφορετικών τύπων ακατέργαστης γλυκερόλης, η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος, καθώς και των συνθηκών καλλιέργειας (συνθήκες pH,αεροβίωση/αναεροβίωση, τρόπος επίτευξης αναεροβίωσης), στην αύξηση και την παραγωγήμεταβολικών προϊόντων. Και τα τέσσερα στελέχη μεταβόλισαν σημαντικές ποσότητες γλυκερόλης,με μέγιστη συγκέντρωση καταναλωθέντος υποστρώματος ~217,0 g/L, στην ημι-συνεχήκαλλιέργεια του στελέχους E. aerogenes FMCC-10, υπό αερόβιες συνθήκες. Η μέγιστησυγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης (PDmax) 68,1 g/L, σημειώθηκε σε αναερόβια ημι-συνεχήκαλλιέργεια του στελέχους C. freundii FMCC-B 294 (VK-19), με τον αντίστοιχο συντελεστήαπόδοσης παραγόμενης 1,3-προπανοδιόλης ανά καταταλωθείσα γλυκερόλη (YPD/Gly) να λαμβάνειτιμή YPD/Gly=0,40 g/g και η παραγωγικότητα 0,79 g/L/h. Παράλληλα σημαντική ποσότητα τηςδιόλης (50,1 g/L) σχηματίστηκε κατά την ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια του στελέχουςK. oxytoca FMCC-197, υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Και οι δύο τιμέςαποτελούν τις μέγιστες συγκεντρώσεις της διεθνούς βιβλιογραφίας για παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης από φυσικά στελέχη για τα συγκεκριμένα είδη και συγκαταλέγονται στιςυψηλότερες τιμές παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης από βιομηχανική γλυκερόλη. Με βάση τα όσαείμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιείται αύξηση του είδους K.oxytoca σε ακατέργαστη γλυκερόλη.Αναφορικά με την μέγιστη συγκέντρωση 2,3-βουτανοδιόλης (BDmax) σε υπόστρωμαακατέργαστης γλυκερόλης, που ήταν 78,2 g/L, καταγράφηκε κατά την αύξηση του στελέχους E.aerogenes FMCC-10 σε ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια υπό αερόβιες συνθήκες. Στην ενλόγω καλλιέργεια εφαρμόστηκε η τεχνική του διακυμαινόμενου pH, σύμφωνα με την οποία μετάαπό κάθε ανατροφοδότηση, το pH αυξάνονταν στην τιμή 7,0 και στη συνέχεια έμενε μη σταθερό,συνδυάζοντας έτσι δύο παραμέτρους που βρέθηκε ότι επηρεάζουν την παραγωγή της 2,3-βουτανοδιόλης. Αφενός μεν ήταν μη-ελεγχόμενο σε ελαφρώς όξινο εύρος pH, γεγονός απαραίτητογια την σύνθεση της διόλης, αφετέρου δε, δεν ξεπέρασε μια κατώτατη τιμή pH που είναιπαρεμποδιστική για τον μεταβολισμό της γλυκερόλης. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά πουμελετήθηκε η παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης ως το κύριο προϊόν ζύμωσης από ακατέργαστηγλυκερόλη, καθώς το υπόστρωμα αυτό έχει συνδεθεί στενά με την προπανοδιολική ζύμωση, κατάτην οποία η 2,3-βουτανοδιόλη αποτελεί παραπροϊόν της ζύμωσης και παράγεται σε αρκετάμικρότερες ποσότητες. ς εκ τούτου, η τιμή αυτή αποτελεί την μέγιστη της διεθνούς βιβλιογραφίαςπου έχει αναφερθεί τόσο σε υπόστρωμα καθαρής όσο και βιομηχανικής γλυκερόλης. Συγχρόνως,αποτελεί ενδιαφέρο εύρημα η σύνθεση του μεταβολίτη από γλυκερόλη υπό αερόβιες συνθήκες,δεδομένου ότι ο μεταβολισμός της γλυκερόλης τελείται, κατά κύριο λόγο, υπό αναερόβιεςσυνθήκες.Ιδιαίτερα υψηλή ήταν και η μέγιστη παραγόμενη ποσότητα αιθανόλης (EtOHmax) απόβιομηχανική γλυκερόλη, που ήταν 33,4 g/L και σημειώθηκε στην καλλιέργεια του στελέχους C. freundii FMCC-207, κατά την αύξηση του σε αναερόβια ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια.Η συγκέντρωση αυτή αποτελεί, μέχρι στιγμής, την υψηλότερη τιμή της διεθνούς βιβλιογραφίαςτόσο από φυσικά όσο και από ανασυνδυασμένα στελέχη, κατά την καλλιέργεια τους σευποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Εξίσου υψηλές ποσότητες σχηματίστηκαν καιστις ημι-συνεχείς καλλιέργειες των στελεχών K. oxytoca FMCC-197 και E. aerogenes FMCC-10(25,2 και 20,9 g/L, αντίστοιχα).Τέλος, μια ακόμη παράμετρος που εξετάστηκε ήταν η εφαρμογή των μη-ασηπτικώνσυνθηκών καλλιέργειας στην αφομοίωση της γλυκερόλης και στην σύνθεση μεταβολικώνπροϊόντων, κατά την διενέργεια ασυνεχών και ημι-συνεχών τροφοδοτούμενων καλλιεργειών. Σεόλες τις περιπτώσεις, η απουσία στείρων συνθηκών αποδείχθηκε ότι δεν έχει σημαντική επίδρασηστον μεταβολισμό της γλυκερόλης και από τα τέσσερα εξεταζόμενα στελέχη, ωστόσο σημειώθηκεμικρή μείωση στην τελική συγκέντρωση των παραγόμενων μεταβολικών προϊόντων, συγκριτικά μετις αντίστοιχες καλλιέργειες σε στείρες συνθήκες. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι ηαπουσία ασηπτικών συνθηκών καλλιέργειας μπορεί να αποτελέσει μια ενδιαφέρουσα παράμετρογια την αξιοποίηση της ακάθαρτης γλυκερόλης προς προϊόντα υψηλότερη αξίας σε βιομηχανικόεπίπεδο, καθώς η εφαρμογή των μη-ασηπτικών συνθηκών ελαχιστοποιεί το κόστος ενέργειας γιατην αποστείρωση, αλλά και το συνολικό κόστος για τον εξοπλισμό. Μαζί με την αξιοποίηση τηςχαμηλού κόστους ακατέργαστής γλυκερόλης ως υπόστρωμα, αυτή η εφαρμογή θα βοηθήσει τηνμικροβιακή μετατροπή της ακατέργαστης γλυκερόλης προς 1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόληκαι αιθανόλη ώστε να γίνει μια οικονομικά ανταγωνιστική βιολογική διεργασία.