Οι νευροτροφικές δράσεις ενδογενών και συνθετικών νευρο - στεροειδών: μελέτες δομής-λειτουργίας των αλληλεπιδράσεων τους με υποδοχείς νευροτροφινών και ο βιολογικός τους ρόλος στην νευροπροστασία

Abstract

Neuronal cell fate is majorly governed by the actions of growth factors, such as neurotrophins. These specific ligands and their receptors activity are regulated by multiple cellular parameters. Indeed, we have recently shown that neurosteroid dehydroepiandrosterone (DHEA) prevents neuronal apoptosis through binding to NGF receptors, namely TrkA and p75NTR. In this study we provide evidence that DHEA interacts with the other two mammalian neurotrophin receptors, i.e., the TrkB and TrkC, as well as their invertebrate counterparts (orthologs) in mollusks Lymnaea and Aplysia, and in cephalochordate fish Amphioxus, supporting the hypothesis that during evolution DHEA may have served as a primordial neurotrophic factor, promoting neuronal survival in species with less complex nervous systems. A large number of experimental and clinical studies suggest that endogenous neurotrophins are involved in the pathopysiology of many neurodegenerative diseases. However, despite their demonstrated beneficial effects on neuronal survival and protection, the therapeutic usefulness of neurotrophins is compromised by their polypeptide nature and their restricted penetrance to the blood-brain barrier (BBB). To overcome this limitation, small molecules –like DHEA- which could mimic the effects of neurotrophic factors would be therapeutically ideal. However, DHEA is metabolized in vivo to sex steroids, affecting the endocrine system. We have recently synthesized 17-spiro analogs of DHEA with anti-apoptotic, neuroprotective properties (IC50 at nanomolar levels), deprived of androgenic-estrogenic actions. In the present study, we report that synthetic DHEA derivative, BNN27, specifically interacts with both NGF receptors, TrkA and p75NTR, at nanomolar concentrations. BNN27 induces TrkA tyrosine phosphorylation, affecting downstream signaling of Akt and MAPKs in sympathetic neurons and regulates TrkA internalization, however in a different time pattern than that of NGF. Moreover, BNN27 was shown to promote the interaction of p75NTR receptors with its effector factors RhoGDI, RIP2 and TRAF6. It also significantly reverses apoptosis of NGF-dependent embryonic sensory neurons of NGF null mice. BNN27 itself was not effective in to mimicking NGF in the induction of neurite elongation, perhaps due to its differential endosome’s turn over. However, combination of BNN27 with NGF results in enhancement of neurites’ length. BNN27 may serve as a lead molecule to develop BBB permeable, neurotrophin-like small molecules (microneurotrophins) with potential applications in the treatment of neurodegenerative diseases and brain disorders.

Η οικογένεια των Νευροτροφινών αποτελείται στα θηλαστικά από 4 πολυπεπτιδικά μόρια, τα NGF (Nerve Growth Factor), BDNF (Brain Derived Growth Factor), NT-3 (Neurotrophin-3) και Neurotrophin-4/5 (Neurotrophin-4/5). Οι πρωτεϊνες αυτές ταυτοποιήθηκαν αρχικά σαν παράγοντες επιβίωσης των συμπαθητικών κι αισθητικών νευρώνων κι έκτοτε έχει δειχθεί πως ελέγχουν μια σειρά προ-επιβιωτικών λειτουργιών, ανάπτυξης και κυτταρικής λειτουργίας τόσο στον νευρικό ιστό όσο και σε άλλα συστήματα του οργανισμού.Οι βιολογικές δράσεις κάθε νευροτροφικού παράγοντα διαμεσολαβούνται μέσω ειδικών κυτταρικών υποδοχέων που ανήκουν σε ένα ή περισσότερα μέλη της οικογένειας των κινασών τυροσίνης (Trk, Tropomyocin-related Kinase) TrkA, TrkB ή TrkC. Επιπροσθέτως, όλες οι νευροτροφίνες προσδένονται και ενεργοποιούν τον παν-υποδοχέα p75NTR, που ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων του TNF (Tumor Necrosis Factor). Εκτός των κλασσικών ενδογενών Νευροτροφινών, πρόσφατα δεδομένα κατέδειξαν για πρώτη φορά ότι και μια άλλη κατηγορία ενδογενών νευροπροστατευτικών μορίων, όπως το Νευροστεροειδές Διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) διαθέτει την ικανότητα να αλληλεπιδρά άμεσα με τους υποδοχείς TrkA και p75NTR, ενεργοποιώντας τα σηματοδοτικά μονοπάτια που εκκινούν από τους υποδοχείς αυτούς. Το Νευροστεροειδές DHEA παράγεται στο κεντρικό νευρικό σύστημα, εκτός της βασικής θέσης παραγωγής τους στη περιφέρεια, το φλοιό των επινεφριδίων. Έχει προταθεί η πιθανή θεραπευτική χρησιμότητα του στην αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών διαδικασιών, όπως οι νόσοι του Parkinson και Alzheimer αλλά και το εγκεφαλικό τραύμα και η ισχαιμία, και η Σκλήρυνση κατά Πλάκας, διαδικασίες στις οποίες παρατηρείται έντονη αποπτωτική απώλεια νευρώνων. Εν τούτοις η in vivo βιομετατροπή τους σε οιστρογόνα και ανδρογόνα καθιστά την κλινική τους χρήση προβληματική. Η ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων της DHEA, που στερούνται ενδοκρινών δράσεων και διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, παρέχει την δυνατότητα ανάπτυξης νέων μορίων ως μικρομοριακοί αγωνιστές των υποδοχέων των νευροτροφινών, και παρέχουν την δυνατότητα για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών ουσιών με νευροπροστατευτικές και πιθανές νευροαναγεννητικές ιδιότητες.Η παρούσα εργασία στόχευσε κατ’ αρχάς την μελέτη της ικανότητας του νευροστεροειδούς DHEA να αλληλεπιδρά και με τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των υποδοχέων νευροτροφινών (TrkB και TrkC), αλλά και με τα αρχέγονα ανάλογά τους, Ltrk, ApTrk και AmphiTrk. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας ανέδειξαν την ικανότητα της DHEA να λειτουργεί ως ένας πιθανός αρχέγονος νευροτροφικος παράγοντας προάγοντας την νευρωνική επιβίωση σε είδη με λιγότερο σύνθετα νευρικά συστήματα.Σημαντικός αριθμός πειραματικών και κλινικών μελετών υποστηρίζει την συμμετοχή των ενδογενών νευροτροφινών στην παθοφυσιολογία των νευροεκφυλιστικών νόσων και την πιθανή τους χρησιμότητα στην θεραπευτική τους. Εν τούτοις η κλινική θεραπευτική χρησιμότητα των νευροτροφινών περιορίεται από την πρωτεϊνική τους φύση και την αδυναμία τους να διέλθουν τον αιματεγκεφαικό φραγμό. Η προσπάθεια διεθνώς έχει εστιασθεί στην ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων των Νευροτροφινών με νευροτροφικές, νευροπροστατευτικές δράσεις. Η ικανότητα της DHEA να συνδέεται και να ενεργοποιεί τους υποδοχέις των νευροτροφινών αποκτά ιδιαίτερη φαρμακολογικό ενδιαφέρον, ιδιαίτερα αυτή συνθετικών της αναλόγων, στα οποία απουσιάζουν οι ενδοκρινικές δράσεις. Η παρούσα εργασία εστίασε κυρίως στην μελέτη της ικανότητας ενός πρότυπου συνθετικού αναλόγου της DHEA, του BNN27 να αλληλεπιδρά και να ενεργοποιεί εκλεκτικά τους υποδοχείς του Νευρικού Αυξητικού Παράγοντα (NGF). Αρχικά, μελετήθηκε η ικανότητα πρόσδεσης του BNN27 στους υποδοχείς των Νευροτροφινών (Trk και p75NTR). Δεδομένα που προέκυψαν από πειράματα ανταγωνισμού σύνδεσης ([3Η]-DHEA displacement experiments) ανέδειξαν το BNN27 ως πιθανό αγωνιστή των υποδοχέων TrkA και p75NTR με Ki της τάξης του 1.86±0.4nM και 3.9±1.2nM για TrkA και p75NTR αντίστοιχα. Σε αντίθεση με την DHEA, το BNN27 δεν έδειξε χημική συγγένεια με τους υποδοχείς TrkB, TrkC, υποστηρίζοντας ότι η σύνδεση του ΒΝΝ27 είναι εκλεκτική. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα του ΒΝΝ27 να επάγει συγκεκριμένα ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια ευαίσθητα στον φυσιολογικό προσδέτη, τον NGF. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε η ικανότητα του ΒΝΝ27 να επάγει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα TrkA σε κύτταρα που τον εκφράζουν ενδογενώς (όπως οι συμπαθητικοί νευρώνες σε πρωτογενή καλλιέργεια ή η κυτταρική σειρά PC12) ή μετά από παροδική διαμόλυνση CHO κυττάρων με το cDNA του TrkA. Η επίδραση του BNN27 (100 nΜ) ήταν τόσο αποτελεσματική όσο και του NGF (100ng/ml) στην επαγωγή της φωσφορυλίωσης των TrkA υποδοχέων σε χρόνο 20 λεπτών, υποδηλώνοντας ότι η σύνδεση του BNN27 στους TrkA υποδοχείς είναι λειτουργική. Αντιθέτως, το BNN27 απέτυχε να επάγει τη φωσφορυλίωση του TrkB και TrkC υποδοχέα. Επίσης, με μελέτες ανοσοκατακρήμνισης διαπιστώθηκε η ικανότητα του BNN27 να ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με τον υποδοχέα p75NTR. Μια από τις πρωτεΐνες που προσδένονται με τον p75NTR είναι η πρωτεϊνική κινάση RIP2, η οποία μπορεί να προσδένεται στην Death Domain (DD) του p75NTR μέσω της CARD περιοχής του. Μια επιπλέον πρωτεΐνη που έχει τη δυνατότητα να προσδένεται στην DD του p75NTR είναι ο αναστολέας της απόσπασης του GDP από την Rho (RhoGDP Dissociation Inhibitor, RhoGDI). Έχει δειχθεί ότι η αλληλεπίδραση του p75NTR με την RhoGDI επάγει την ενεργοποίηση της Rho, γεγονός που φαίνεται να συμβαίνει μέσω της απελευθέρωσης της Rho από την RhoGDI που οφείλεται στην αναδιαμόρφωση της στερεοδιάταξης της RhoGDI από την πρόσδεση στον p75NTR. Πειράματα σε πρωτογενείς καλλιέργειες γλοιακών κυττάρων Schwann που εκφράζουν ενδογενώς τον p75NTR ή κύτταρα που δεν εκφράζουν τον p75NTR (MEF, ΗΕΚ, CHO) παρά μόνο μετά από διαμόλυνση τους με το cDNA του p75NTR ανέδειξαν την ικανότητα του BNN27 (100nM) να στρατολογεί την RIP2 και τον TRAF6 στον p75NTR (20 λεπτά), ενώ διευκόλυνε την απομάκρυνση της RhoGDI από τον p75NTR (30 λεπτά). Πειραματικά δεδομένα ανέδειξαν την ικανότητα του ΒΝΝ27 να αναστρέψει στατιστικά σημαντικά την απόπτωση που προκαλείται λόγω στέρησης του νευροτροφικού παράγοντα (NGF) σε πρωτογενείς καλλιέργειες συμπαθητικών νευρώνων απομονωθέντων από τα ανώτερα θωρακικά συμπαθητικά γάγγλια (SCGs) νεογέννητων αρουραίων. Επίσης, χορήγηση του ΒΝΝ27 κατά την διάρκεια τις κύησης οδήγησε σε μείωση τις αποπτωτικής απώλειας των TrkA θετικών αισθητικών νευρώνων των νωτιαίων γαγγλίων που παρατηρείται κατά την 14η εμβρυική μέρα (Ε14) στους διαγονιδιάκους ngf-/- ποντικούς. Σε αντίθεση με τον NGF, το ΒΝΝ27 δεν ήταν ικανό να προκαλέσει τη διαφοροποίηση των PC12 κυττάρων σε νευρώνες.Οι διαφορές στα ευρήματα που παρατηρήθηκαν ίσως να οφείλονται σε διαφορετική σενσχέση με τον NGF διαδικασία της ενδοκυττάρωσης του υποδοχέα TrkA.Συμπερασματικά, η ανάπτυξη μικρομοριακών αναλόγων της DHEA, όπως του ΒΝΝ27 που στερούνται ενδοκρινών δράσεων και διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, παρέχει την δυνατότητα ανάπτυξης νέων συνθετικών μορίων (lead molecules) ως αγωνιστές των υποδοχέων των νευροτροφινών, στοχεύοντας στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων των νευροεκφυλιστικών νόσων και του εγκεφαλικού τραύματος.