Μελέτη φυσιολογικών χαρακτηριστικών στελεχών του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes απομονωθέντων από γαλακτοκομικές επιχειρήσεις

Abstract

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen involved in numerous outbreaks with high fatality rates, many of them associated with dairy products. Dairy products are commonly ready-to-eat (RTE) food and the evaluation of their ability to support growth of the pathogen is crucial for risk assessment. Important factors that affect the behavior of L. monocytogenes in food (kinetics, growth interface, etc) are their intrinsic physicochemical parameters (pH, aw), the environmental parameters (T, atmosphere), the production procedure and the physiology of pathogen’s cells. The aim of the study was to evaluate the behavior of L. monocytogenes cells isolated from the environment and products of cheese factories in situations that occur during cheesemaking in a typical dairy plant. A survey of the surfaces and products of 6 Greek dairy plants was conducted during 2007-2009 for the occurrence of L. monocytogenes, as well as other foodborne pathogens and indicators. It resulted in 4 L. monocytogenes isolates (1%), 8 Listeria sp isolates (2%) and 4 Salmonella spp. isolates (4,5%). Additionally, 5,1% and 8,9% of tested samples were found above detection limit for S. aureus and E. coli respectively. The overall results suggest that there is a window of improvement, in order for them to meet the limits of European regulation 1441/2007. Furthermore, the results stress the need of constant audit of the producers and their suppliers. In the following experiments, the ability of the pathogen to form biofilms on soiled stainless steel surfaces (milk, custard and yogurt) and then detach (mechanically or voluntary) and grow in a new environment was evaluated, in correlation with the cells physiology and the environmental conditions. Better attachment of the cells was found in milk and cream at 20oC, even though their kinetics in milk at 5oC was slower of those formed at 5oC. In yogurt no countable attachment of cells was measured but when the coupons transferred in milk and cream, growth occurred after 7 days of incubation. The commonly used methods of cleaning and disinfection evaluated in this study, including chlorine solution, peracetic acid and QAC, on L. monocytogenes cells with different history (pH, aw, T) resulted in different survival levels of the pathogen depending on its physiology and the disinfection procedure. The results contribute to the knowledge on L. monocytogenes resistance against disinfection, with the comparative study of biofilms and planktonic cells. Moreover, the probability of growth initiation of L. monocytogenes in TSBYE, milk and fresh cheese, depending on inoculum size, physiological state, pH and aw of substrate was evaluated by using logistic regression models. At low inoculation levels biofilms and detached cells interface was towards more favorable conditions than the interface of planktonic cells. At higher inoculums both planktonic and detached cells had similar probabilities of growth. At the comparison between the three substrates, growth boundaries of fresh cheese were the highest (higher aw, pH), followed by the ones of milk and TSBYE, which stressed the importance of model validation on food substrates of different rheological properties. The effect of acid and osmotic shifts within the range of pH and aw levels that allow growth of L. monocytogenes after habituation at no-growth conditions and shift to growth-permitting conditions was evaluated on the growth of the pathogen at 10°C. Maximum specific growth rate of L. monocytogenes was adapted quickly to the new environment while the lag time of the organism increased with all osmotic downshifts, as well as by the reduction of pH to 5.1. Extended habituation at no-growth conditions results suggest that there is an adaptation or injury rate induced at conditions inhibiting the growth of the pathogen depending on the condition. The modified Baranyi model, to include the results of the present study, proved suitable to describe the effect of acid and osmotic shifts in the kinetics of L. monocytogenes in milk. Finally, the effect of the contamination stage and cell physiology on L. monocytogenes behavior during production and ripening of Graviera and Feta cheese was evaluated. L. monocytogenes cells inoculated in pasteurized milk managed to grow during the first days of production of both cheeses, at high level of (106-7 CFU/g). Conversely, inoculation during curd section at Graviera lead to prolonged survival of the pathogen at 103 CFU/g. In both cheeses TSBYE biofilms and milk planktonic cells survived longer than other inoculum preparations. The cells that originated from TSBYE and milk, reached higher concentration than those originated from the Graviera and Feta cheese. The results may address safety implications relevant to the adaptive responses of L. monocytogenes in a dairy processing environment and their ability to survive and proliferate in dairy products, which might pose risks to public health. In conclusion, knowledge of L. monocytogenes behavior during production and distribution of dairy products may assist in quantitative risk assessment and biotraceability, through association of an epidemic strain with its source (i.e., source attribution based on downstream information). Such knowledge may further be useful in systematic epidemiological investigations.

Υψηλό ποσοστό των θανατηφόρων κρουσμάτων παγκοσμίως, που σχετίζονται με την κατανάλωση γαλακτοκομικών προϊόντων, οφείλονται στον παθογόνο μικροοργανισμό Listeria monocytogenes. Στόχο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της συμπεριφοράς απομονωμένων από τυροκομεία στελεχών της L. monocytogenes σε γαλακτοκομικά προϊόντα και σε συνθήκες που απαντώνται στο περιβάλλον μιας γαλακτοβιομηχανίας ή ενός τυροκομείου κατά την παραγωγική διαδικασία. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε έρευνα για την εκτίμηση της υγιεινολογικής κατάστασης των προϊόντων και των επιφανειών παραγωγής Ελληνικών τυροκομείων μεσαίας κλίμακας και του επιπολασμού της L. monocytogenes. Οι υψηλοί πληθυσμοί των μικροοργανισμών δεικτών που μετρήθηκαν, έδειξαν την ανάγκη βελτίωσης των διαδικασιών που ακολουθούνται από τις επιχειρήσεις κατά την παραγωγή προϊόντων και την εξυγίανση των επιφανειών. Ο επιπολασμός των παθογόνων μικροοργανισμών (L. monocytogenes, Salmonella spp, S. aureus και E. coli 0157:H7) βρέθηκε χαμηλός. Με σκοπό την προσομοίωση σεναρίων μεταφοράς του παθογόνου μικροοργανισμού (επιμόλυνση) από τις επιφάνειες επεξεργασίας στα τρόφιμα και το αντίθετο, έλαβαν χώρα πειράματα σχηματισμού, αποκόλλησης βιοϋμενίων της L. monocytogenes και κινητικής τους σε γάλα, κρέμα και γιαούρτι στους 5 και 20oC. Ως βέλτιστη θερμοκρασία σχηματισμού βιοϋμενίων αποδείχθηκαν οι 20oC και ως ευνοϊκότερα για μικροβιακή ανάπτυξη υποστρώματα το γάλα και η κρέμα. Στο γιαούρτι δεν σχηματίστηκαν μετρήσιμα βιοϋμένια, ωστόσο όταν μεταφέρθηκαν κουπόνια από το γιαούρτι σε φρέσκο γάλα και κρέμα παρατηρήθηκε εκούσια αποκόλληση κυττάρων και ανάπτυξη του παθογόνου. Σε πειράματα θερμικής επεξεργασίας και χημικής απολύμανσης βιοϋμενικών και πλαγκτονικών κύτταρων της L. monocytogenes με διαφορετική φυσιολογική κατάσταση παρατηρήθηκε διαφορετική ικανότητα επιβίωσης του παθογόνου, ανάλογα με το είδος και τον χρόνο εφαρμογής του απολυμαντικού, τις συνθήκες σχηματισμού των βιοϋμενίων (pH, aw, T, χρόνος) και το είδος των κυττάρων. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι συνθήκες που επιτρέπουν την αύξηση προσκολλημένων, αποκολλημένων και πλαγκτονικών κυττάρων της L. monocytogenes σε περίπτωση που αυτός βρεθεί σε υγρό θρεπτικό μέσο, γάλα και φρέσκο τυρί. Βρέθηκε ότι τα πλαγκτονικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχύτερα και έχουν υψηλότερη πιθανότητα ανάπτυξης σε δυσμενείς συνθήκες και χαμηλά επίπεδα επιμόλυνσης, σε σχέση με τα αποκολλημένα και τα προσκολλημένα κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα όρια ανάπτυξης σε φρέσκο τυρί και σε γάλα ήταν μετατοπισμένα προς τις άριστες συνθήκες σε σχέση με αυτά σε υγρού μέσου (TSBYE). Η χρήση τροφίμων με διαφορετικά ρεολογικά χαρακτηριστικά, οδήγησε σε ακριβέστερη περιγραφή της πιθανότητας ανάπτυξης της L. monocytogenes. Ακολούθως, μελετήθηκε η κινητική ανάπτυξης του πληθυσμού της L. monocytogenes σε συνθήκες προσομοίωσης μιας διασταυρούμενης επιμόλυνσης στο περιβάλλον ενός τυροκομείου, μέσω της μεταφοράς του μικροοργανισμού σε υποστρώματα με διαφορετικές τιμές pH ή aw. Ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης προσαρμόστηκε άμεσα στο νέο περιβάλλον, ανεξάρτητα από την προϊστορία των κυττάρων. Αντίθετα, η φάση προσαρμογής του παθογόνου επηρεάστηκε τόσο από την διεύθυνση όσο και από το εύρος των μεταβολών, ιδιαιτέρα στις μεταβολές αλατότητας. Με την τροποποίηση του κλασσικού μοντέλου Baranyi βάση των αποτελεσμάτων, ώστε να περιλαμβάνει τόσο την μεταβολή της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων (Q) σε καταστάσεις μη ανάπτυξης, όσο και το έργο προσαρμογής τους σε νέο περιβάλλον με συνθήκες που υποστηρίζουν την ανάπτυξη του μικροβίου, προβλέφτηκε με ακρίβεια η συμπεριφορά του παθογόνου κατά την διάρκεια δυναμικών συνθηκών οξύτητας ή αλατότητας σε γάλα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι κατά την επιβίωση του παθογόνου σε συνθήκες μη ανάπτυξης, λαμβάνουν χώρα διεργασίες προσαρμογής ή τραυματισμού σε επίπεδο κυττάρου, οι οποίες επηρεάζουν την συμπεριφορά του όταν βρεθεί εκ νέου σε περιβάλλον ανάπτυξης, μέσω διασταυρούμενης επιμόλυνσης των τροφίμων. Τέλος, με βάση τη γνώση που αποχτήθηκε από τα προηγούμενα πειράματα, μελετήθηκε η συμπεριφορά στελεχών της L. monocytogenes με διαφορετική φυσιολογία, όταν αυτά βρεθούν σε παστεριωμένο γάλα, τυρόπηγμα και νωπό τυρί, κατά τη διάρκεια τυροκόμησης και ωρίμασης Φέτας και Γραβιέρας. Πρωτίστως το στάδιο επιμόλυνσης και δευτερευόντως η τεχνολογία παρασκευής επηρέασαν σημαντικά την πιθανότητα ανάπτυξης και την κινητική του παθογόνου στα δύο τυριά. Σημαντικό ρόλο στην τεχνολογία της Γραβιέρας διαδραμάτισε η αναθέρμανση του πήγματος, αποτρέποντας την ανάπτυξη του μικροοργανισμού κατά τα πρώτα στάδια της τυροκόμησης. Η φυσιολογία των κυττάρων, όπως διαμορφώθηκε από την έκθεσή τους σε υποθανάτιες ή θανατηφόρες συνθήκες αλατότητας και οξύτητας, ανάλογα με το στάδιο της τυροκόμησης που έλαβε χώρα ο ενοφθαλμισμός, καθόρισε την κινητική τους. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι απαιτείται μεγαλύτερη προσοχή στα πρώτα στάδια της τυροκόμησης, καθώς η επιμόλυνση των προϊόντων ακόμα και με χαμηλούς πληθυσμούς της L. monocytogenes, μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή τυριών με υψηλούς πληθυσμούς του παθογόνου. Συμπερασματικά, η γνώση της συμπεριφοράς της L. monocytogenes κατά μήκος της γραμμής παραγωγής και διάθεσης των γαλακτοκομικών προϊόντων μπορεί να βοηθήσει στην ορθότερη αποτίμηση της επικινδυνότητάς τους και την ευκολότερη διερεύνηση των πηγών επιμόλυνσης κατά τις επιδημιολογικές μελέτες.