Αλληλεπίδραση φλεγμονής και πρωτεασών του συστήματος πήξης

Abstract

Fibrosis is a common pathological situation that affects several organs. It constitutes the anatomical basis for different disorders and is responsible for increased mortality in all modern societies. The coagulation system is actively involved in several fibrotic models through the production of thrombin. Activation of protease-activator receptor-1 signaling (PAR-1), by thrombin, has been implicated in the pathogenesis of several inflammatory disorders and cancer as well. Moreover, the cross-talk between inflammation and activation of the extrinsic coagulation cascade has been described in a number of disease models. It is well accepted that the myofibroblast is a key cell for the connective tissue remodeling, since it takes place in wound healing process and fibrosis development. Moreover, according to previous studies, ET-1 induces the formation and activation of myofibroblast suggesting a role for this mediator in fibrotic process. Hence, in order to study the cross-talk between inflammation and fibrosis mediated by the extrinsic coagulation system, we used the pulmonary fibrotic disease, bronchopulmonary dysplasia (BPD) as a model. The involvement of cross-talk between the tissue factor – thrombin axis and endothelin 1 signaling was studied in systemic sclerosis (SSc). BPD is a life-threatening fibrotic disorder in infants which rapidly progresses toward fibrosis. Previous studies have established the key role of neutrophils, present in the alveolar microenvironment of infants with BPD, in the excessive inflammatory response. Given the involvement of the extrinsic coagulation cascade in animal models of lung fibrosis, we examined its role in BPD. To evaluate the involvement of coagulation in the fibrotic process, primary human colonic myofibroblasts (HCMFs) were treated with BALF supernatants from infants with BPD. These human colonic myofibroblasts demonstrate an enhanced C5a- and thrombin-dependent migration. Moreover, they express TF in an endothelin-1–dependent manner, with subsequent activation of the extrinsic coagulation cascade and CTGF production mediated by PAR-1 signaling. It is important to note that the majority of this set of experiments was performed in human colonic myofibroblasts (HCMFs), because of abundance of cells, whereas some key experiments were further reproduced in lung myofibroblasts. These findings propose a novel role for ET-1 in fibrosis and suggest a mechanism for the amplification of thrombin generation. Molecules able to neutralize the mediators of this process may provide clinical benefits by breaking the vicious cycle. Afterwards, we focused on SSc, a connective tissue disease. SSc affects the skin and the internal organs. The hallmarks of the disease are activation of immune cells, vascular injury, and excessive accumulation of extracellular matrix in skin and affected organs. Given the previously reported activation of the coagulation system in SSc and the efficacy of Bosentan in the reduction of skin fibrosis in SSc, we studied the implication of TF and ET-1 signaling in HCMFs from SSc patients. The experimental procedure was performed in HCMFs from patients with SSc and from control subjects. HCMFs from SSc patients demonstrate increased levels of CCN2, collagen production and migration rate. In addition, increased TF expression is also observed in SSc HCMFs resulting in thrombin generation. Furthermore, we have demonstrated that thrombin induces ETA expression, while ET-1signaling is implicated in the enhanced TF expression of SSc HCMFs. Inhibition of ET-1 signaling by bosentan abolished the TF-mediated fibrotic capacity of HCMFs. The above findings suggest that targeting the extrinsic coagulation system or ET-1 signaling may reduce the risk of fibrotic complications in SSc. In an attempt to elucidate the precise role of neutrophils in fibrotic process, we studied whether neutrophil extracellular traps (NETs) are implicated in this process. NETs are involved in several inflammatory phenotypes, such as inflammation, autoimmunity, thrombosis and cancer. Moreover, it has been demonstrated that neutrophils release NETs under inflammatory stimuli and are involved in several pulmonary disorders. To investigate the precise role of NETs in the fibrotic process, fibrosis-related agents (cigarette smoke, magnesium silicate and bleomycin) or generic NET inducers (PMA) are used. The aforementioned agents are involved in several fibrotic models, characterized by focal inflammation and neutropilic infiltration; however, their precise role in fibrosis is still obscure. CSE, magnesium silicate or bleomycin had in vitro either absence of direct fibrotic induction or LFs were led on apoptosis. NETs structures released by the aforementioned fibrotic agents or non- fibrotic stimuli, such as PMA, induced activation of LFs and differentiation into myofibroblasts. Myofibroblasts demonstrated increased CCN2 expression, collagen production and wound healing, which were depended on NET structures as observed by direct inhibition of chromatin or histones. Moreover, the orchestration of NET release was autophagy driven as confirmed by specific inhibition studies. Interestingly, IL-17 (a primary initiator of inflammation/fibrosis) was expressed in NETs and promoted the fibrotic activity of differentiated LFs but not their differentiation. The above findings were further supported by immunostaining of human fibrotic lung, where traces of NETs were detected in fibrotic lesions, consisting of extracellular neutrophilic elastase surrounding a-SMA expressing fibroblasts.

Η ίνωση είναι μια αρκετά κοινή παθολογική κατάσταση, η οποία προσβάλει διάφορα όργανα και ιστούς. Αποτελεί την ανατομική βάση πολλών ασθενειών και είναι υπεύθυνη για αυξημένη θνησιμότητα σε όλες τις σύγχρονες κοινωνίες. Το εξωγενές σύστημα πήξης εμπλέκεται σε καταστάσεις ίνωσης μέσω της παραγωγής θρομβίνης. Η σηματοδότηση της θρομβίνης μέσω του PAR-1 υποδοχέα διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια των φλεγμονωδών νοσημάτων και του καρκίνου. Παράλληλα, η συνομιλία μεταξύ φλεγμονής και εξωγενούς συστήματος πήξης έχει περιγραφεί σε αρκετά μοντέλα νόσων. Σημαντικό ρόλο στην ίνωση διαδραματίζουν οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες (μυοϊνοβλάστες), ενώ η ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ-1) επάγει το σχηματισμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων. Έτσι, για τη μελέτη του μηχανισμού της ίνωσης, έχοντας ως άξονα τη φλεγμονή και το εξωγενές σύστημα πήξης, επιλέχθηκε το μοντέλο της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας (BPD) σε νεογνά και το μοντέλο του συστηματικού σκληροδέρματος (SSc). Το BPD είναι μία ινωτική διαταραχή απειλητική για τη ζωή του νεογνού, η οποία εξελίσσεται ταχύτατα. Τα ουδετερόφιλα, που ανιχνεύονται στο κυψελιδικό μικροπεριβάλλον των νεογνών με BPD φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις της νόσου. Με βάση τα προηγούμενα ευρήματα του Εργαστηρίου Μοριακής Αιματολογίας σε σχέση με το μοντέλο της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας και τη συμμετοχή του εξωγενούς συστήματος πήξης σε ζωικά μοντέλα πνευμονικής ίνωσης, διερευνήσαμε το ρόλο του εξωγενούς συστήματος πήξης στις ινωτικές εκδηλώσεις της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας των νεογνών. Οι μυοϊνοβλάστες αποτέλεσαν τον κυτταρικό πληθυσμό-στόχο, ενώ το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με BPD αποτέλεσε το βασικό διεγέρτη όλων των πειραμάτων (case group). Ως control group χρησιμοποιήθηκε το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (RDS). Μυοϊνοβλάστες εντέρου από υγιή δότη χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα αυτού του μοντέλου, ενώ τα πιο κρίσιμα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε επαναληπτικές δοκιμασίες με τη χρήση μυοϊνοβλαστών πνεύμονα. Διαπιστώθηκε ότι οι μυοϊνοβλάστες που επωάστηκαν με το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με BPD εμφανίζουν αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης, η οποία εξαρτάται από την αναφυλατοξίνη C5a και τη θρομβίνη. Επιπλέον, οι μυοϊνοβλάστες εκφράζουν ιστικό παράγοντα (TF), με τρόπο που ρυθμίζεται από την ενδοθηλίνη-1 και κατόπιν παράγουν αυξητικό παράγοντα συνδετικού ιστού (CCN2), μέσω PAR-1 σηματοδότησης. Στη συνέχεια, η μελέτη μας στράφηκε στη νόσο του συστηματικού σκληροδέρματος. Το SSc είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα, το οποίο προσβάλλει το δέρμα καθώς και εσωτερικά όργανα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού, η αγγειακή βλάβη και η υπέρμετρη εναπόθεση ινώδους συνδετικού ιστού στα προσβαλλόμενα όργανα αποτελούν τα πιο βασικά χαρακτηριστικά της νόσου. Καθώς το εξωγενές σύστημα πήξης ενεργοποιείται στη συγκεκριμένη νόσο και η χορήγηση Βosentan περιορίζει σημαντικά την ίνωση του δέρματος των ασθενών με SSc, διερευνήσαμε τη συνομιλία μεταξύ του άξονα TF-θρομβίνης και της σηματοδότησης της ενδοθηλίνης-1 στην ινωτική δραστηριότητα που παρατηρείται στη νόσο. Ειδικότερα, μελετήσαμε τις ιδιότητες, τη συμπεριφορά και την εμπλοκή των μυοϊνοβλαστών στη νόσο του συστηματικού σκληροδέρματος. Πραγματοποιήσαμε μία σειρά πειραμάτων στα οποία συμμετείχαν μυοϊνοβλάστες από ασθενείς με σκληρόδερμα (SSc HCMFs-case group) και μυοϊνοβλάστες από υγιείς δότες (Control HCMFs-control group). Παρατηρήσαμε ότι οι μυοϊνοβλάστες των ασθενών με SSc εμφανίζουν αυξημένη παραγωγή CCN2, κολλαγόνου και αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα. Η συμπεριφορά τους αυτή εξαρτάται άμεσα από τη θρομβίνη. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μυοϊνοβλάστες των ασθενών έχουν αυξημένη έκφραση TF. Διαπιστώσαμε ότι η ενεργοποίηση του εξωγενούς συστήματος πήξης αυξάνει την έκφραση του υποδοχέα Α της ενδοθηλίνης (ETA), η οποία εξαρτάται από τη θρομβίνη. Η υπερ-έκφραση του ETA συμβάλλει σε περαιτέρω αύξηση τόσο της έκφρασης του TF όσο και της ινωτικής δραστηριότητας των μυοϊνοβλαστών. Η χορήγηση του Bosentan, που δρα ανασταλτικά στη σηματοδότηση της ενδοθηλίνης-1, αναστέλλει σημαντικά την ινωτική δραστηριότητα των μυοϊνοβλαστών, η οποία είναι εξαρτώμενη από τον TF. Συνοψίζοντας, τόσο το εξωγενές σύστημα της πήξης όσο και η ET-1 συμμετέχουν καθοριστικά στις ινωτικές εκδηλώσεις του BPD και του SSc. Παράλληλα, υποδεικνύουν νέους θεραπευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση των ινωτικών επιπλοκών των νόσων. Λαμβάνοντας τα αποτελέσματα σχετικά με το ρόλο της ίνωσης από τα προαναφερθέντα μοντέλα, το ενδιαφέρον μας στράφηκε στη διερεύνηση του ρόλου των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης (ΝΕΤs) στην ινωτική διαδικασία. Μελέτες του Εργαστηρίου Μοριακής Αιματολογίας και πολυάριθμα δεδομένα από άλλα ερευνητικά κέντρα υπέδειξαν τη συμμετοχή των NETs στη φλεγμονή, στην αυτοανοσία, στην αντιγονοπαρουσίαση και στον καρκίνο. Για να μελετηθεί η συμμετοχή των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης στην ινωτική διαδικασία χρησιμοποιήθηκαν παράγοντες που σχετίζονται με την ίνωση (όπως είναι το εκχύλισμα τσιγάρων καπνού (CSE), το πυρητικό μαγνήσιο και η μπλεομυκίνη), αλλά και μη ινωτικά μόρια (όπως είναι το PMA). To CSE, το πυρητικό μαγνήσιο και η μπλεομυκίνη σχετίζονται με διάφορα μοντέλα ίνωσης, στα οποία τα ουδετερόφιλα συμμετέχουν καθοριστικά. Ωστόσο ο μηχανισμός εκδήλωσής της ίνωσης παρουσία αυτών των παραγόντων αλλά και η συμμετοχή των ουδετεροφίλων στην εκδήλωσή της παραμένει ασαφής. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης, διαπιστώθηκε ότι τα ινωτικά μόρια δεν επάγουν την ινωτική διαδικασία όταν παρέχονται άμεσα στου ινοβλάστες. Αντίθετα, τα ουδετερόφιλα από υγιείς δότες σχηματίζουν εξωκυττάρια ουδετεροφιλικά δίκτυα χρωματίνης ύστερα από επώαση με τους ινωτικούς παράγοντες. Διαπιστώθηκε μάλιστα ότι ο σχηματισμός των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης εξαρτάται από την αυτοφαγία και την κιτρουλινοποίηση των ιστονών. Επιπλέον, οι ινοβλάστες που επωάζονται με τις δομές των ουδετεροφίλων [οι οποίες σχηματίζονται είτε από τα παραπάνω ινωτικά μόρια είτε από μη-ινωτικούς διεγέρτες (ΡΜΑ)], ενεργοποιούνται, διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες (ενεργοποιημένοι ινοβλάστες) και εκδηλώνουν ινωτική συμπεριφορά. Η συμμετοχή των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης στη διαφοροποίηση/ενεργοποίηση των ινοβλαστών διαπιστώθηκε με ειδική αναστολή της χρωματίνης και των ιστονών, με τη χρήση DNase I και ηπαρίνης αντίστοιχα. Επιπλέον, η IL-17, η οποία αποτελεί εναρκτήριο μόριο της φλεγμονής/ίνωσης, εντοπίστηκε πάνω στα ΝΕΤs που απελευθερώνονται παρουσία αυτών των ινωτικών ή μη παραγόντων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι IL-17 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ινωτική συμπεριφορά των ήδη διαφοροποιημένων ινοβλαστών (μυοϊνοβλάστες). Tα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ανθρώπινο πνευμονικό ιστό με (εκτεταμένη) ίνωση, όπου εντοπίστηκαν εξωκυττάρια δίκτυα χρωματίνης σε εστίες με ίνωση και σε εγγύς θέσεις με ενεργοποιημένους ινοβλάστες. Τα ευρήματα αυτά φανερώνουν τον καθοριστικό ρόλο των ουδετεροφίλων στο μηχανισμό της ίνωσης και παρέχουν αρκετά σημεία για θεραπευτικές παρεμβάσεις.