Ανάπτυξη μεθόδων εκτίμησης της εσωτερικής ακτινευαισθησίας και της προστατευτικής δράσης της αμιφοστίνης σε καρκινοπαθείς υπό ακτινοθεραπεία

Abstract

Cancer, a group of diseases characterized by uncontrolled cell proliferation, is the second cause of death after heart diseases. Radiation therapy is an effective method for cancer treatment, as monotherapy or in combination with surgical therapy and chemotherapy. The radiation used in radiotherapy is ionizing, which carries enough energy to liberate electrons from atoms or molecules. The liberation of electrons leads to free radical formation. The formation of the free radicals in cell nuclei reacts with nucleic acids, leading to instability and DNA double strand break (DSB) formation. Once DSBs are formed, Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) phosphorylates H2AX histone at the C-terminus, where the recognition motif Ser–Gln–Glu [SQE] is located. After ATM activation, the Mre11 ⁄ Rad50 ⁄ Nbs1 complex binds to DNA breaks. A formation of large irradiation-induced foci [IRIFs] follows the initial recruitment of DNA repair factors to the DSB. Failure of normal cell repair machinery leads to cell death and dysfunction of tissues and organs. This is reflected in the clinical semiology and symptomatology of patients as ‘radiation early toxicity’. Although toxicity generally settles, cells' dysfunction may persist and lead to chronic dysfunction called ‘radiation late toxicity’. Moreover, Amifostine is a broad spectrum cytoprotective drug used for alleviating the side effects of radiation toxicity.Our attempt was to develop a test that can predict the early radiation induced toxicity, which would be a useful tool to design individualized radiotherapy schedules for cancer patients. SF2 is an index of cell viability after exposure to 2Gy, more often applied for the characterization of intrinsic radiosensitivity in tumor models. H2AX phosphorylation (γH2AX), on the other hand, being directly involved in DNA damage and repair, consists of a strong target for the development of biomarkers related to tissue radiosensitivity. As PBMCs can be easily obtained from the patients' peripheral blood, we postulated that assessment of SF2 and of H2AX phosphorylation kinetics in these very cells, could predict for early radiation toxicities in patients undergoing radiotherapy. Moreover, the study of γH2AX expression kinetic in normal cells and the in vivo study in presence of Amifostine, answers the question whether Amifostine protects from the DNA damage.Thus, in this study, we used PBMCs from the peripheral blood of patients to assess the SF2 at 4h and 24h after ex-vivo irradiation. Proliferating blood cells are considered as an early responding tissue, which justifies the selection of these easily obtained cells to study eventual correlations with early radiotherapy toxicities. Indeed, after the evaluation of SF2 at 86 patient, we conclude that the low SF2 related significantly with high grade acute toxicities. Our next step was the study of phosphorylated γH2AX expression. Western blot analysis that detects the density of γΗ2ΑΧ protein in millions of cells was, therefore, considered a reliable methodological approach to study irradiated PBMCs. After quantification of the western blot band densities, we examined with linear regression analysis the relation between early toxicity (CTCAE grade system) and the γH2AX-ratio. At 30min, analysis revealed a significant inverse association. Low γH2AX-ratio was linked with high toxicity grade. The low γH2AX ratio associated with a high toxicity grade. So, we suggest that at 30 min after irradiation, the detectable γH2AX expression levels are the result, mainly, of the intensity of an ‘acute phase repair processes activity’, so that the higher expression of γH2AX shows the higher attempt for repair. This hypothesis explains why patients with low levels γH2AX at 30 minutes, were more sensitive to radiation.We further examined a parameter, namely the ‘late phase repair process’, which is the ability of cells to repair long-term residual damage, from 30 minutes to 24 hours. The kinetics of the restoration of γΗ2ΑΧ levels back to basic levels (control levels) could be quantified using the ‘relative γH2AX-ratio’. This ratio is defined as the expression levels of γH2AX protein at 4 hours to expression levels of γH2AX protein at 30 minutes (intermediate phase repair) and the expression levels of γH2AX protein at 24 hours to the expression levels of γH2AX protein at 4 hours (long repair phase). So with these two ratios, we were able to characterize the repair rate of DNA damage within the first 4 hours following irradiation and the one taking place after 4 hours up to 24 hours. A significant direct association of RγH2AX-ratio(4h) with early radiation toxicities was noted, which suggests that persistent γH2AX levels 4h after irradiation indicates increased intrinsic radiosensitivity. No association of early toxicity with RγH2AX-ratio(24h), thus the protracted repair process, was noted. Furthermore we investigated the cytoprotective effect of amifostine in normal mouse liver cell (NCTC) survival using the Alamar Blue® method. In addition, we assessed the association between the DNA repair mechanisms and the phosphorylation of histone H2AX, in presence of Amifostine, using Western analysis and Immunocytochemistry (confocal microscopy). Experiments showed that the viability of the cells was increased in the presence of Amifostine, suggesting that amifostine significantly protects cells against radiation. Irradiation of cells lead to a significant increase of γH2AX levels in hepatocyte nuclei 30 min after irradiation, whereas significant levels of expression remained even after 24 hours. Conversely, the induction of γH2AX in presence of amifostine was reduced, and the expression levels returned to basic levels (control) after 24 hours. These results confirm the significant cytoprotective action on amifostine against radiation, as the DNA damage decreased and the DNA repair rate was rapid.Then we studied the cytoprotective effect of amifostine in vivo in 8 patients (control group), treated with radiation alone and in 9 patients (group amifostine), treated with radiation supported with amifostine injected subcutaneously (500mg) 30 minutes before irradiation. In patients not receiving amifostine, 4/8 showed a significant elevation of γH2AX levels after irradiation in vivo. In contrast, patients who received amifostine before irradiation, the γH2AX levels increased only slightly in 1/9 patients. The γH2AX levels increase was statistically significant in patients not receiving amifostine, whereas maintained constant in patient who had received amifostine prior radiotherapy. The above results are a strong indication for the protective effect of amifostine against the DNA damage induced by radiation.In conclusion, these findings demonstrate that SF2 is an important prognostic factor for early toxicity induced by radiation and that western blot analysis of γH2AX expression allows the evaluation of cell repair mechanism kinetics. The distinction of the early, intermediate and prolonged phase of DNA damage repair, as explained by the kinetics of γH2AX expression levels, is a completely new proposal which revises the manner to analyze these biomarkers. Also, the method for detecting DNA damage in peripheral PBMCs after in vivo irradiation of patients under radiotherapy, proved feasible and leads to new areas for optimizing the herein developed method for the prediction of early radiation toxicity.

Ο καρκίνος, μια ομάδα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό κυττάρων, αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου μετά τις καρδιόπαθειες. Η ακτινοθεραπεία είναι μια αποτελεσματική μέθοδος θεραπείας, τόσο ως αυτόνομη θεραπεία όσο και σε συνδυασμό με την χειρουργική θεραπεία και την χημειοθεραπεία. Η ακτινοβολία που χρησιμοποιείται κατά την ακτινοθεραπεία είναι η ιονίζουσα ακτινοβολία η οποία όταν εισέρχεται μέσα στην ύλη πυροδοτεί μια αλυσίδα αντιδράσεων, λόγο του ιονισμού (αποβολή ηλεκτρονίων) που προκαλεί στα άτομα του υλικού. Η αποβολή ηλεκτρονίων οδηγεί στο σχηματισμό ελευθέρων ριζών. Η δημιουργία ελευθέρων ριζών μέσα στο χώρο του πυρήνα του κύτταρου έχει ως αποτέλεσμα την αντίδραση τους με τα μόρια των νουκλεϊκών οξέων, προξενώντας αστάθεια και ρήξη της αλυσίδας του DNA (Double strand breaks-DSB). Μετά το σχηματισμό της ρήξης, τα κύτταρα άμεσα επιστρατεύουν συγκεκριμένους επιδιορθωτικούς ενζυμικούς μηχανισμούς. Ένα από τα πρώτα γεγονότα που λαμβάνει χώρα μετά την δημιουργία της διπλής ρήξης είναι η φωσφορυλίωση του C τελικού άκρου της ιστόνης Η2ΑΧ στους ανώτερους ευκαρυωτές (η φωσφορυλιωμένη μορφή καλείται γ-H2AX) από την πρωτεΐνη Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) που αναγνωρίζει το μοτίβο Ser–Gln–Glu (SQE) στο C τελικό άκρο της ιστόνης H2AX. Μετά την ενεργοποίηση της, ακολουθεί η πρόσδεση του Mre11⁄ Rad50⁄ Nbs1 συμπλόκου στο DSB. O σχηματισμός μια δομής επαγόμενης από την ακτινοβολία (large irradiation-induced- IRIFs) ακολουθεί την στρατολόγηση των επιδιορθωτικών παραγόντων στην περιοχή του DSB. Αποτυχία λειτουργίας της επιδιορθωτικής μηχανής των φυσιολογικών κυττάρων, οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο και δυσλειτουργία των ιστών και των οργάνων του οργανισμού που κλινικά αντικατοπτρίζεται στη σημειολογία και συμπτωματολογία των ασθενών ως πρώιμη ακτινική τοξικότητα. Αν και η τοξικότητα γενικά υποχωρεί, η κυτταρική δυσλειτουργία μπορεί να παραμείνει και να οδηγήσει τα όργανα σε χρόνια δυσλειτουργία η οποία ονομάζεται όψιμη ακτινική τοξικότητα. Η Αμιφοστίνη είναι ένα ευρέως φάσματος κυτταροπροστατευτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται για την προφύλαξη από την τοξικότητα της ακτινοθεραπείας.Σκοπός της μελέτης μας η ανάπτυξη ενός διαγνωστικού τεστ που θα μπορούσε να προβλέψει την πρώιμη τοξικότητα που προκαλείται από την ακτινοβολία και να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για το σχεδιασμό εξατομικευμένων χρονοδιαγραμμάτων ακτινοθεραπείας για τους ασθενείς με καρκίνο. Ο Survival index at 2Gy (SF2) είναι ένας δείκτης κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από έκθεση σε 2Gy και εφαρμόζεται συχνά για τον χαρακτηρισμό της ενδογενούς ακτινευαισθησίας των όγκων. Η γH2AX, από την άλλη πλευρά, όντας άμεσα εμπλεκόμενη στη ανίχνευση της βλάβης και επιδιόρθωσης του DNA, αποτελεί ένα σημαντικό στόχο για την ανάπτυξη των βιοδεικτών σχετιζόμενων με την ακτινοευαισθησία των ιστών. Επιπροσθέτως, η Αμιφοστίνη είναι ένα κυτταροπροστατευτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται κατά την ακτινοθεραπεία για τη μείωση των ακτινο-εξαρτώμενων παρενεργειών. Καθώς τα PBMCs μπορούν εύκολα να ληφθούν από το περιφερικό αίμα των ασθενών και είναι ένας ιστός πρώιμα ανταποκρινόμενος στην ακτινοβολία, θεωρήσαμε ότι η εκτίμηση του SF2 και της κινητικής της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης Η2ΑΧ σε αυτά τα κύτταρα, θα μπορούσε να αποδειχθεί σημαντικός δείκτης πρόβλεψης της πρώιμης τοξικότητας της ακτινοθεραπείας. Επιπλέον, η μελέτη της έκφρασης-κινητικής της γΗ2ΑΧ σε φυσιολογικά κύτταρα καθώς και η in vivo μελέτη της παρουσία Αμιφοστίνης θα μας απαντούσε στο ερώτημα κατά πόσο η Αμιφοστίνη προστατεύει στο επίπεδο του DNA. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε PBMCs απομονωμένα από περιφερικό αίμα των ασθενών και εκτιμήσαμε τον SF2 στις 4 ώρες και 24 ώρες μετά την ex-vivo ακτινοβόληση. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του αίματος θεωρούνται από τους πρώτους ιστούς που εμφανίζεται η ακτινική τοξικότητα. Πράγματι, μετά την αξιολόγηση του SF2 σε 86 ασθενείς και την συσχέτιση αυτού με την πρώιμη τοξικότητα, συμπεράναμε ότι ο χαμηλός SF2 σχετίζεται σημαντικά με τον υψηλό βαθμό οξείας τοξικότητας. Το επόμενο μας βήμα ήταν η μελέτη της κινητικής της έκφρασης της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης γH2AX. Η ανάλυση κατά Western, με την όποια θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε την πυκνότητα της πρωτεΐνης γΗ2ΑΧ σε εκατομμύρια κυττάρων θεωρήθηκε η πιο αξιόπιστη μεθοδολογική προσέγγιση για τη μελέτη των ακτινοβολημένων PBMCs. Μετά από κατά Western ανάλυση και ποσοτικοποίηση με πυκνομετρία των ζωνών της πρωτεΐνης, εξετάσαμε με linear regression analysis τη συσχέτιση της πρόωρης τοξικότητας (CTCAE grade system) με τον λόγο της γH2AX (γH2AX-ratio). Στα 30 λεπτά, βρέθηκε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση. Ο χαμηλός λόγος γH2AX συνδέεται με υψηλό βαθμό τοξικότητας. Υποθέσαμε λοιπόν ότι στα 30 λεπτά μετά την ακτινοβόληση, τα ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης της γH2AX είναι αποτέλεσμα, κυρίως, της έντασης της δραστηριότητας της διαδικασίας οξείας φάσης επισκευής (acute phase repair process), συνεπώς όσο υψηλότερη είναι η έκφραση της γH2AX τόσο υψηλότερη είναι και η άμεση προσπάθεια επισκευής. Αυτή η υπόθεση εξηγεί το λόγω που οι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα γΗ2ΑΧ στα 30 λεπτά είχαν και μεγαλύτερη ευαισθησία στην ακτινοβολία. Εν συνέχεια, εξετάσαμε την ικανότητα των κυττάρων να επισκευάζουν την υπολειμματική βλάβη, δηλαδή μελετήσαμε τη διάρκεια της φάσης επισκευής μετά τα 30 λεπτά έως και 24 ώρες (late phase repair process). Η κινητική της επαναφοράς των επιπέδων έκφρασης της γΗ2ΑΧ στα βασικά επίπεδα (επίπεδα ελέγχου) αξιολογήθηκαν με τον προσδιορισμό "σχετικού λόγου της γH2AX" (relative γH2AX-ratio). Ο λόγος αυτός ορίζεται ως επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης γH2AX (4 ώρες) προς επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης γH2AX (30 λεπτά) (ενδιάμεση φάση επιδιόρθωσης) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης γH2AX (24 ώρες) προς τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης γH2AX(4 ώρες) (παρατεταμένη φάση επιδιόρθωσης). Έτσι με τους δύο αυτούς σχετικούς λόγους μπορέσαμε να χαρακτηρίσουμε την ταχύτητα επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA κατά τις πρώτες 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση αλλά και μετά τις 4 ώρες έως και τις 24. Σημειώθηκε μια σημαντική άμεση συσχέτιση του λόγου της RγH2AX στις 4 ώρες (RγH2AX-ratio(4h)) με την πρώιμη τοξικότητα της ακτινοβολίας, γεγονός που επιβεβαιώνει ότι η επίμονη της έκφρασης των επίπεδων της γH2AX, 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση (αργή ενδιάμεση φάση επιδιόρθωσης) υποδηλώνει αυξημένη ενδογενή ακτινοευαισθησία. Δεν παρατηρήσαμε κάποια συσχέτιση της πρόωρης τοξικότητας με τον λόγο της RγH2AX στις 24 ώρες (RγH2AX-ratio(24h)) δηλ. την ταχύτητα της παρατεταμένης επιδιορθωτικής φάσης. Σε επόμενη φάση μελετήσαμε την κυτταροπροστατευτική επίδραση της Αμιφοστίνης στην κυτταρική επιβίωση των φυσιολογικών κυττάρων ήπατος μυός NCTC με την μέθοδο AlamarBlue® αλλά και στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA που σχετίζονται με τη φωσφορυλίωση της ιστόνης Η2ΑΧ με ανοσοαποτύπωμα κατά Western και με ανοσοϊστοχημεία με συνεστιακή μικροσκοπία. Από τα αποτελέσματα μας προκύπτει ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων αυξήθηκε παρουσία Αμιφοστίνης σε όλο το χρονικό διάστημα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αμιφοστίνη προστάτευσε σημαντικά τα κύτταρα από τη ακτινοβολία. Επίσης, τα πειράματά μας έδειξαν ότι η ακτινοβολία οδήγησε στην σημαντική αύξηση της γΗ2ΑΧ στον πυρήνα των ηπατοκυττάρων 30min μετά την ακτινοβόληση, ενώ σημαντικά επίπεδα έκφρασης παρέμειναν ακόμη και μετά από 24 ώρες. Αντίθετα, η επαγωγή της γΗ2ΑΧ παρουσία αμιφοστίνης ήταν πολύ μικρή και τα επίπεδα επέστρεψαν στα φυσιολογικά μετά από 24 ώρες. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη σημαντική κυτταροπροστατευτική δράση της αμιφοστίνης έναντι της ακτινοβολίας καθότι τόσο η βλάβη του DNA ήταν πολύ μικρότερη αλλά και ο ρυθμός επιδιόρθωσης αυτής ήταν ταχύς.Ακολούθως μελετήσαμε την κυτταροπροστατευτική δράσης της αμιφοστίνης in vivo σε 8 ασθενείς (ομάδα έλεγχου) που λάμβαναν θεραπεία μόνο με ακτινοβολία και σε 9 ασθενείς (ομάδα αμιφοστίνης) στην οποία λάμβαναν θεραπεία με ακτινοβολία 30 λεπτά, μετά από υποδόρια χορήγηση αμιφοστίνης (500mg υποδορίως). Στους ασθενείς που δεν έλαβαν αμιφοστίνη, 4/8 έδειξαν μια σημαντική αύξηση των επιπέδων της γΗ2ΑΧ μετά την in vivo ακτινοβόληση. Αντίθετα, στους ασθενείς που έλαβαν αμιφοστίνη πριν την ακτινοβόληση, η γΗ2ΑΧ αυξήθηκε ελαφρά μόνο σε 1/9 ασθενείς. Η αύξηση της γΗ2ΑΧ ήταν στατιστικά σημαντική στους ασθενείς που δεν έλαβαν αμιφοστίνη, ενώ διατηρήθηκε σταθερή αυτούς που είχαν λάβει αμιφοστίνη πριν την ακτινοθεραπεία. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποτελούν μια σημαντική ένδειξη για την προστατευτική δράση της αμιφοστίνης έναντι των βλαβών του DNA που επάγονται από την ακτινοβολία. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αποδεικνύουν ότι ο SF2 είναι ένας σημαντικός προγνωστικός παράγοντας για την πρώιμη τοξικότητα που προκαλείται από την ακτινοβολία και ότι η western blot ανάλυση της έκφρασης της γH2AX επιτρέπει την εκτίμηση της κινητικής του μηχανισμού επιδιόρθωσης των κυττάρων. Η διάκριση μιας πρώιμης, ενδιάμεσης και παρατεταμένης φάσης επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA, όπως μελετήθηκε με παραμέτρους που εξήγαμε από την κινητική της έκφρασης της πρωτεΐνης γΗ2ΑΧ, είναι μια εντελώς νέα πρόταση που αναθεωρεί τον τρόπο με τον οποίο επιβάλλεται να αναλύονται αυτοί οι βιοδείκτες. Επίσης, η μέθοδος ανίχνευσης των βλαβών του DNA σε περιφερικά PBMCs μετά από in vivo ακτινοβόληση των ασθενών υπό ακτινοθεραπεία, αποδείχτηκε απόλυτα εφικτή και ανοίγει νέους δρόμους για την βελτιστοποίηση της μεθόδου πρόβλεψης της πρώιμης ακτινικής τοξικότητας που αναπτύξαμε στην παρούσα διατριβή.