Μελέτη βιολογικών ρόλων των SR πρωτεϊνικών κινασών σε Κ562 ερυθρολευχαιμικά κύτταρα: εμφάνιση αυτοαντισωμάτων απέναντι στην SRPK1 σε ασθενείς με νόσο Alzheimer

Abstract

SPRK1 represents the most studied member of the serine/arginine family of kinases, which specifically phosphorylate serine residues within serine-arginine⁄arginine-serine domains. During the first part of this study, we investigated the possible impact of SRPK1 down-regulation, by applying RNAi technology, in K562 cells. Down-regulation of SRPK1 expression levels in K562 cells induces erythroid differentiation. A dominant cytoplasmic distribution of SRPK1 was observed in these cells, whereas a minor fraction of the kinase was found in the nucleus. Interestingly, a fraction of the cytoplasmic kinase, was found to be associated with polysomes.SRPK1 post-transcriptional down-regulation results in decreased phosphorylation of a certain number of proteins associated with the polysomal fraction. Following LC-MS/MS analysis, we identified a set of 28 proteins, participating in various aspects of mRNA maturation, transport and translation. TAF15 was one of the identified proteins. We present evidence that TAF15 is not phosphorylated by SRPK1. However, these two proteins were found to interact in vitro via SRPK1’s first catalytic domain and most importantly TAF15 was shown to negatively regulate SRPK1 activity. TAF15 localizes almost exclusively in the nucleus of K562 and HeLa cells. Taking into account the prevalent cytoplasmic localization of SRPK1, the two proteins do not seem to interact under normal cellular conditions. However, SRPK1 translocates to the nucleus, following genotoxic stress of HeLa cells, where it co-localizes with TAF15 in the periphery of particular subnuclear structures. This interaction is functional, as TAF15 could inhibit SRPK1-mediated splicing of a reporter gene, in an in vivo splicing assay. In the second part of this study, we investigated the potential implication of SRPK1 in the immunopathobiological mechanisms leading to Alzheimer’s disease (AD) development, by detecting specific autoantibodies against SRPK1 in the sera and cerebrospinal fluid of AD patients. In particular, a significant difference in anti-SRPK1 serum autoantibodies between Alzheimer’s disease patients and control individuals was observed (p=0.031). Furthermore, the epitopes mainly recognized by the antibodies in AD patients were mapped within the first catalytic domain of the kinase (p= 0.029). Elevated levels of SRPK1 autoantibodies were also detected in cerebrospinal fluid samples of the patients.

Η SRPK1 αποτελεί το πιο καλά μελετημένο μέλος της οικογένειας κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης, φωσφορυλιώνοντας σερίνες σε επαναλαμβανόμενα μοτίβα σερίνης/αργινίνης. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, διερευνήσαμε τις επιπτώσεις της καταστολής της SRPK1, με την τεχνική της RNA παρεμβολής, στα κύτταρα Κ562. Παρατηρήθηκε ότι η καταστολή της έκφρασης της κινάσης στα κύτταρα Κ562 προκαλεί την διαφοροποίησή τους προς ερυθροκύτταρα. Η κινάση εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα και ένα μέρος της ανιχνεύθηκε στα πολυσώματα. Η καταστολή της SRPK1, επιφέρει μείωση του επιπέδου φωσφορυλίωσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από το εκχύλισμα των πολυσωμάτων. Ύστερα από ανάλυση LC-MS/MS, ταυτοποιήθηκαν 28 πρωτεΐνες, οι οποίες σχετίζονται με τις διαδικασίες ωρίμανσης, μεταφοράς και μετάφρασης του mRNA. Μία από τις πρωτεΐνες που ανιχνεύθηκαν ήταν η TAF15. Στην παρούσα διατριβή δεν παρατηρήθηκε φωσφορυλίωση της TAF15 από την SRPK1. Ωστόσο, δείχτηκε ότι οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν in vitro, μέσω της πρώτης καταλυτικής περιοχής της SRPK1 και μάλιστα βρέθηκε ότι η TAF15 αναστέλλει τη δράση της SRPK1. Η TAF15 κατανέμεται κυρίαρχα στο πυρήνα κυττάρων Κ562 και HeLa, ενώ ένα μέρος της εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Δεδομένης της κυτταροπλασματικής κατανομής της SPRK1, οι δύο πρωτεΐνες υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν φαίνεται να συνεντοπίζονται. Ωστόσο, υποβάλλοντας τα κύτταρα σε γενοτοξικό stress, παρατηρήθηκε μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα, όπου και συνεντοπίζεται με την TAF15, γύρω από συγκεκριμένες υποπυρηνικές δομές. Η συνεντόπιση αυτή φαίνεται να έχει και λειτουργική σημασία, αφού σε δοκιμασία in vivo ματίσματος διαπιστώθηκε καταστολή του ματίσματος ενός γονιδίου αναφοράς από την TAF15. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήσαμε την ενδεχόμενη συμμετοχή της SRPK1 σε ανοσοβιολογικούς παθογενετικούς μηχανισμούς της νόσου Alzheimer, με την ανίχνευση ειδικών αυτοαντισωμάτων που στοχεύουν στην SRPK1 στον ορό και εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών με νόσο Alzheimer. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον τίτλο αυτοαντισωμάτων έναντι της SRPK1 στον ορό των ασθενών με νόσο Alzheimer, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες (p=0.031). Μάλιστα, διαπιστώθηκε ότι η πρώτη καταλυτική περιοχή της κινάσης αποτελεί την κύρια αντιγονική περιοχή που αναγνωρίζεται από τα αντι-SPRK1 αυτοαντισώματα στους ασθενείς (p=0.029). Παράλληλα, διαπιστώσαμε την ύπαρξη των συγκεκριμένων αυτοαντισωμάτων και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, όπου παρατηρήθηκε αυξημένη παρουσία τους στους ασθενείς.