In vitro παραγωγή εμβρύων βοοειδών σε υποστρώματα τροποποιημένα με γουαϊαζουλένιο ή γκρελίνη

Abstract

The aim of this thesis was to study the effects of antioxidants during the phases of in vitro bovine embryo production, and to unravel their role on embryo yield and quality after quantification of particular gene markers. Under conditions that do not promote oxidation (low oxygen concentration) two antioxidants, one exogenous-the guaiazulene- and one endogenous –the ghrelin-were studied. Oocytes collected from slaughtered cows were in vitro matured for 24 hours in TCM199 supplemented with FCS and EGF. Matured oocytes were fertilized, the gametes were cocultured for 24 hours and putative zygotes were cultured in groupos of 25 in synthetic oviductal fluid. Day 7 blastocyst were frozen in liquid nitrogen for analysis of mRNA abundance of genes related to oxidation, metabolism, implantation, and apoptosis. Addition of 0.1mM or 0.01mM of guaiazulene in IVM or IVC media did not affect either blastocyst formation rate or the expression of the 7 genes studied. Modification of IVM medium with the addition of 200 pg/ml, 800 pg/ml and 2000pg/ml of ghrelin significantly suppressed blastocyst formation rates. When maturation time was shortened to 18 hours, more ghrelin treated oocytes reached metaphase II compared to untreated controls, no difference was noted after 24 hour IVM. Irrespectively of the duration of IVM, cumulus layer was more expanded in ghrelin treaterd oocytes compared to controls. 18 hour oocyte maturation in the presence of ghrelin, increased blastocyst yield compared to that of oocytes matured for 24 hours. Significant differences were detected in various genes’ expression giving an overall notiuon that oocytes matured for 24 hours in the presence of ghrelin are over matured or aged. Nonetheless, the hatching rate of blastocysts that were produced from oocyted exposed to ghrelin, were high suggesting improved embryo quality.The presence of ghrelin at the aforementioned concentrations, in the culture medium, significantly suppressed blastocyst formation rate. However, daily replacement of the culture medium reversed the former result causing a significant increase in blastocyst yield. Differences were detected in mRNA abundance of various genes revealing that embryos produced in the presence of ghrelin can be considered of improved quality. Our results provide evidence that ghrelin accelerates oocyte maturation, and drastically affects early embryo development. Collectively, the results of the present thesis show that oxidation is not a major hurdle during IVP, provided that the conditions used do not promote the development of oxidative phenomena. Conversely, endogenous antioxidant substances – such as ghrelin- can potently affect embryo yield and quality by interfering through multiple pathways related to developmental competence, metabolism, methylation, apoptosis and/or oxidation.

Σκοπός της διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος αντιοξειδωτικών ουσιών σε όλα τα στάδια της εξωσωματικής παραγωγής εμβρύων βοοειδών, και να αποτυπωθεί ο ρόλος τους στην ποσοτική απόδοση σε έμβρυα και στην ποιότητα τους, με εκτίμηση συγκεκριμένων γονιδιακών δεικτών. Σε περιβάλλον που δεν προάγει την ανάπτυξη οξειδωτικών φαινομένων (χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου), μελετήθηκαν δύο αντιοξειδωτικές ουσίες, μια εξωγενής – το γουαϊαζουλένιο και μία ενδογενής , η γκρελίνη. Ωάρια σφαγίων αγελάδων ωρίμαζαν για 24 ώρες σε TCM199 εμπλουτισμένο με ορό εμβρύου μόσχου και επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, στη συνέχεια γονιμοποιούνταν, οι γαμέτες συνεπωάζονταν για άλλες 24 ώρες και τέλος οι ζυγώτες καλλιεργούνταν σε ομάδες των 25 σε συνθετικό υγρό ωαγωγού. Βλαστοκύστεις της ημέρας 7 καταψύχονταν για ποσοτικό προσδιορισμό (qRT-PCR) του mRNA γονιδίων, που σχετίζονται με την οξείδωση, το μεταβολισμό, τη δυνατότητα εμφύτευσης του εμβρύου, την απόπτωση. Προσθήκη γουαϊαζουλένιου σε συγκεντρώσεις 0.1 mM και 0.01mM στην IVM ή στην IVC δεν επηρέασε το ποσοστό παραγωγής εμβρύων ούτε διαφοροποίησε την έκφραση 7 γονιδίων που μελετήθηκαν. Προσθήκη γκρελίνης σε συγκεντρώσεις• 200 pg/ml, 800 pg/ml και 2000pg/ml, στο υπόστρωμα ωρίμανσης μείωσε σημαντικά το ποσοστό παραγωγής βλαστοκύστεων. Με σύμπτυξη του χρόνου ωρίμανσης στις 18 ώρες βρέθηκε ότι σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες, περισσότερα ωάρια που καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες με την παρουσία γκρελίνης έφτασαν στην μετάφαση ΙΙ, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές για τις ομάδες στις οποίες η ωρίμανση διήρκεσε 24 ώρες. Στις 18 και 24 ώρες, η στιβάδα των κοκκωδών κυττάρων ήταν περισσότερο διατεταμένη στα COCs που ωρίμασαν υπό την παρουσία γκρελίνης. To ποσοστό σχηματισμού βλαστοκύστεων ήταν μεγαλύτερο μετά από ωρίμανση των ωαρίων για 18 ώρες, σε σχέση με αυτό των 24. Διαφορές εντοπίστηκαν σε διάφορες γονιδιακές εκφράσεις, οι οποίες οδηγούν στην εκτίμηση ότι η παρουσία της γκρελίνης για 24 ώρες οδηγεί στην υπερ-ωρίμανση / γήρανση των ωαρίων. Όμως, τα υψηλά ποσοστά εκκόλαψης των βλαστοκύστεων που αναπτύχθηκαν από ωάρια, τα οποία εκτέθηκαν σε γκρελίνη, δείχνουν ότι οι τελευταίες είναι καλύτερης ποιότητας από αυτές των ομάδων των μαρτύρων. Η παρουσία γκρελίνης στο υπόστρωμα καλλιέργειας των εμβρύων μείωσε σημαντικά το ποσοστό παραγωγής βλαστοκύστεων. Όμως η καθημερινή ανανέωση του υποστρώματος αύξησε σημαντικά το ποσοστό των παραγόμενων εμβρύων. Διαφορές ανιχνεύθηκαν στην έκφραση των γονιδίων, που οδηγούν στην εκτίμηση ότι η γκρελίνη βελτίωσε την ποιότητα των εμβρύων. Συνάγεται ότι η δράση της γκρελίνης, αφορά τόσο επιτάχυνση της διαδικασίας ωρίμανσης των ωαρίων, αλλά και σε επίπεδο ανάπτυξης του πρώιμου εμβρύου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής δείχνουν ότι όταν οι συνθήκες παραγωγής δεν ευνοούν την οξείδωση, το οξειδωτικό στρες δεν είναι μείζον πρόβλημα για την εξωσωματική παραγωγή εμβρύων. Αντιθέτως, ενδογενείς αντιοξειδωτικές ουσίες –όπως η γκρελίνη- είναι δυνατό να επηρεάσουν την διαδικασία της παραγωγής και την ποιότητα των εμβρύων μέσω πολλαπλών λειτουργικών οδών, που σχετίζονται με το μεταβολισμό, τη δυνατότητα ανάπτυξης, την απόπτωση, τη μεθυλίωση ή και την οξείδωση.