Η επίδραση της ερυθροποιητίνης στην οξεία νεφρική ισχαιμία: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

The effect of erythropoietin on acute renal ischemia.Experimental study in rats.Erythropoietin (EPO) exhibits pleiotropic properties. The aim of this study was to investigate the effect of EPO on acute renal ischemia/reperfusion (RI/R). Male Wistar rats randomly divided into two groups: I/R (n=12) and EPO I/R group (500 IU/Kg, i.p, 20 min prior ischemia, n=15), were subjected to bilateral renal ischemia for 45 min. Three subgroups were defined in each group, in which reperfusion occurred in 6, 24 and 48 hours respectively. Rats subjected to identical surgical procedure without occlusion of renal pedicles constituted the control group (n=6). Renal injury was assessed by measurement of serum biochemical markers (urea and creatinine) and histological grading. The expression of Cyt c, nNOS, iNOS, eNOS and COX-2 was studied immunohistochemically, while Fas/FasL, nNOS and Cyt c were evaluated by RT-PCR. I/R caused deterioration of the biochemical markers and installation of histological lesions. EPO pretreatment reduced I/R-induced tubular injury and ameliorated renal function. Fas/FasL and Cyt c mRNA were isolated from normal kidneys. Fas/FasL mRNA expression did not change in both groups. RI/R caused an increase in the gene and protein expression of Cyt c (mostly in 48 and 6hrs respectively). EPO limited gene expression of Cyt c in 48hrs and restricted its protein expression mostly in 6hrs. The expression of nNOS in normal kidneys was decreased in 6hrs of reperfusion, while it tended to be restored later. EPO maintained its expression in the controls’ levels in 6hrs. Limited and faint expression of iNOS was observed in normal kidneys. iNOS immunostaining was gradually increased from 6 to 24hrs of reperfusion in tubules and vessels. EPO restrained the intensity of iNOS expression. The presence of eNOS was evident in normal renal vessels and tubules. An induction of eNOS expression occurred in 6 and 24hrs of reperfusion, while in the EPO group it was noted only in 24hrs and in tissues with severe damage. COX-2 is normally expressed in macula densa and tubules. An increase of COX-2 was noted in 6hrs, which subsided later. EPO restricted the inductive peak of 6hrs. Conclusively, the administration of EPO was renoprotective. RI/R and EPO did not affect the expression of Fas/FasL. The early induction of Cyt c suggests its participation in the subsequent injury installation. The beneficial effect of EPO manifests itself through the intrinsic apoptotic pathway. nNOS participates in normal renal function. Its early, post-ischemic reduction, except of consequence of injury, was possibly directly harmful. The inductive effect of EPO on nNOS correlated with an increased number of viable tubules. iNOS post-ischemic induction correlated with the installation of tubular injury. Its attenuation by EPO is a result of its anti-inflammatory and antioxidant properties. The increase of eNOS subsided after the installation of severe injury. The effect of EPO was not related to eNOS directly. COX-2 participates in renal homeostatic mechanisms. Its induction during reperfusion is interpreted as a further activation of these functions or/and as a trigger for inflammation. The beneficial effect of EPO restricts the mobilisation of homeostatic mechanisms or/and the harmful role of COX-2.

Η επίδραση της ερυθροποιητίνης στην οξεία νεφρική ισχαιμία. Πειραματική μελέτη σε επίμυες.Η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) εμφανίζει πλειοτροπικές ιδιότητες. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της ΕΡΟ στην οξεία νεφρική ισχαιμία/επαναιμάτωση (ΝΙ/Ε). Άρρενες επίμυες Wistar υποβλήθηκαν σε αμφοτερόπλευρη NΙ/Ε 45 λεπτών. Χωρίστηκαν τυχαία στις ομάδες Ι/Ε (n=34) και EPΟ (χορήγηση 500 IU/kg, i.p, 20 λεπτά πριν την ισχαιμία, n=36). Σε κάθε ομάδα ορίστηκαν τρεις υποομάδες, στις οποίες η επαναιμάτωση ολοκληρώθηκε στις 6, 24 και 48 ώρες αντίστοιχα. Χειρουργηθέντες επίμυες που δεν υποβλήθηκαν σε ισχαιμία αποτέλεσαν τους μάρτυρες (n=10). Η νεφρική βλάβη εκτιμήθηκε με βιοχημικούς δείκτες (ουρία και κρεατινίνη) και διαβάθμιση της έκτασης της σωληναριακής βλάβης. Η έκφραση των Cyt c, nNOS, iNOS, eNOS και COX-2 μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά και των Fas/FasL, nNOS και Cyt c με RT-PCR. Η ΝΙ/Ε προκάλεσε επιδείνωση των βιοχημικών δεικτών και εγκατάσταση ιστολογικών αλλοιώσεων. Στην ομάδα EPΟ διαπιστώθηκαν χαμηλότερες τιμές βιοχημικών δεικτών και μικρότερης έκτασης σωληναριακή βλάβη (p<0,05). mRNA των Fas/FasL και Cyt c απομονώθηκαν από τους φυσιολογικούς νεφρούς. Το Fas/FasL mRNA δεν μεταβλήθηκε στις δύο ομάδες. Η ΝΙ/Ε προκάλεσε αύξηση της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης του Cyt c (κυρίως στις 48 και στις 6 ώρες αντίστοιχα). Η ΕΡΟ μείωσε την γονιδιακή έκφραση του Cyt c στις 48 ώρες, ενώ περιόρισε την πρωτεϊνική έκφρασή του κυρίως στις 6 ώρες. Η έκφραση της nNOS στους φυσιολογικούς νεφρούς μειώθηκε σημαντικά στις 6 ώρες επαναιμάτωσης, ενώ στη συνέχεια έτεινε να αποκατασταθεί. Η ΕΡΟ διατήρησε την έκφραση της nNOS στις 6 ώρες στα επίπεδα των μαρτύρων. Περιορισμένη έκφραση της iNOS παρατηρείται στους φυσιολογικούς νεφρούς. Η iNOS ανοσοαντίδραση αυξήθηκε σταδιακά από τις 6 στις 24 ώρες επαναιμάτωσης στα σωληνάρια και αγγεία. Η ΕΡΟ περιόρισε την ένταση της iNOS έκφρασης μεταϊσχαιμικά. Η eNOS εκφράζεται στα φυσιολογικά σωληνάρια και αγγεία. Επαγωγή της σημειώθηκε στις 6 και 24 ώρες στην ομάδα Ι/Ε, ενώ στην ΕΡΟ ήταν εμφανής μόνο στις 24 και στους ιστούς με μεγάλη βλάβη. Η COX-2 εκφράζεται φυσιολογικά σε πυκνές κηλίδες και σωληνάρια. Επαγωγή της σημειώθηκε στις 6 ώρες επαναιμάτωσης, η οποία στη συνέχεια υποχώρησε. Η ΕΡΟ περιόρισε αυτήν την επαγωγική αιχμή της COX-2 των 6 ωρών. Συμπερασματικά, η χορήγηση της ΕΡΟ ήταν νεφροπροστατευτική. Η ΝΙ/Ε και η ΕΡΟ δεν επηρέασαν την έκφραση των Fas/FasL. Η πρώιμη επαγωγή του Cyt c υποδηλώνει συμμετοχή του στην μεταγενέστερη εγκατάσταση βλάβης. Η ευεργετική δράση της ΕΡΟ εκδηλώνεται μέσω του ενδογενούς αποπτωτικού μονοπατιού. Η nNOS συμμετέχει στη φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Η πρώιμη εξασθένιση της μετά την ισχαιμία, εκτός από επακόλουθο της βλάβης, είναι πιθανά άμεσα επιζήμια. Η επαγωγική δράση της ΕΡΟ στην nNOS συσχετίζεται με αυξημένο αριθμό βιώσιμων σωληναρίων. Η μεταϊσχαιμική επαγωγή της iNOS συνδέθηκε με την εγκατάσταση σωληναριακής βλάβης. Η εξασθένιση της iNOS από την ΕΡΟ είναι αποτέλεσμα των αντιφλεγμονωδών και αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων της. Η αύξηση της eNOS στη ΝΙ/Ε υποχώρησε μετά την εγκατάσταση σοβαρής βλάβης. Η δράση της ΕΡΟ δεν συσχετίζεται άμεσα με την eNOS. Η COX-2 συμμετέχει στους ομοιοστατικούς νεφρικούς μηχανισμούς. Η επαγωγή της στη ΝΙ/Ε ερμηνεύεται ως περαιτέρω ενεργοποίηση αυτών των μηχανισμών ή/και ως πυροδότηση φλεγμονής. Η ευεργετική δράση της ΕΡΟ περιορίζει την κινητοποίηση των μηχανισμών ομοιόστασης ή/και τον επιβλαβή ρόλο της COX-2.