Προσδιορισμός διαφόρων ανοσοβιολογικών παραμέτρων σε αρθριτικούς επίμυς: κυτταρική και γονιδιακή θεραπεία

Abstract

Higher organisms activate the acute phase response, as a response tointrinsic and extrinsic factors, in order to restore homeostasis. A1-acidglycoprotein (AGP) is a major acute phase protein that is significantly increasedduring acute phase response or in chronic inflammatory reactions, such asrheumatoid arthritis. AGP is a highly glycosylated molecule that can be found,theoretically, in 105 different isoforms. It has been shown that the increase ofAGP concentration in the serum, after systemic administration of pure AGP, leadsto the deterioration of arthritis symptoms in AA rats while treatment with honeybee venom is accompanied by complete suppression of the disease. The dorsal airpouch system simulates the joint as it comprises a membrane similar to thesynovial that functions as a mechanical barrier and it can be used to examine thelocal activity of AGP.The aim of this study is to determine the microheterogeneity of AGPsynthesis and glycosylation during the development of arthritis in rat blood serumand bone marrow in comparison with the respective responses occurred in theFCA-treated air pouch model of facsimile synovium tissue. In addition, the aim is:(a) to determine the role of AGP in the mechanism of arthritis pathogenesis inrats and (b) to investigate the potential role of cells, that exhibit a specificpattern of the synthesis of AGP isoforms, in the development of arthritis in rats.The development of arthritis in rats is accompanied by themicroheterogeneity of the synthesis of various AGP isoforms that is observed inblood and bone marrow as well as the significant reduction of the number of bonemarrow cells due to their mobilization to the peripheral system. The results of thisthesis accentuated 45 kDa AGP isoform as the exclusively secreted isoform duringthe systemic acute phase response. This isoform is synthesized in blood PMN cellsof AA rats while it is not synthesized in bone marrow cells. The 45 kDa AGPisoform synthesis in blood PMN cells and secretion in plasma are increased beforethe onset of arthritis. Arthritic rat bone marrow exhibits biphasic synthesis of the55 kDa AGP isoform as indicated by the reduction before the onset of arthritis andthe significant increase during the active phase of the disease. This studyhighlights that systemic production and secretion of the 45 kDa AGP isoform inassociation with the reduction of the local production of 55 kDa AGP isoform inthe bone marrow are events potentially related to the homeostatic activity of AGPor the mechanism of AA development in rats. In addition, systemic administrationof anti-AGP antibodies ameliorates the symptoms of arthritis while the systemicoverexpression of the 45 kDa AGP isoform exhibits dual immunoregulatoryactivity as it accelerates the onset and accentuates the severity of the disease,but prevents joint deformation.The results of this thesis confirm the morphological data that show similaritybetween the joint and the air pouch system. In addition, it is shown that FCA inthe air pouch activates, as occurs in the joint of AA rats, the production ofimmunoregulatory factors, such as inflammatory factors (COX-1, COX-2),cytokines (IFNγ, IL-8, TNFα) and receptors (TLRs). Differential activation of AGPsynthesis occurs in the FCA-treated air pouch system since the air pouchmembrane mainly produces the 45 kDa AGP while infiltrated PMN cells mostlysecrete the high molecular weight AGPs. The 55 kDa AGP is not secreted in theair pouch exudates early after FCA treatment. Cellular therapy with localadministration of normal BM granulocytic cells producing the 55 kDa AGP or airpouch PMN cells producing the 45 and 55 kDa AGP in the joint impairs theprogression of arthritis. The 50 kDa AGP is mainly secreted by air pouchmembrane cells and potentially by the endothelial cells of the membrane vesselsacting as an inhibitory anti-inflammatory molecule of cell extravasation.In conclusion, this study provides evidence that demonstrates the dualimmunoregulatory activity of AGP that depends on the microenvironment in whichAGP is produced as well as the post-translational glycosylation, thus renderingthis molecule a candidate for the application of therapeutic approaches thatinclude gene, cellular or cellular/gene therapy.

Ως απόκριση σε ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες, οι ανώτεροιοργανισμοί ενεργοποιούν την απόκριση οξείας φάσης με σκοπό την επαναφοράτης ομοιόστασης. Η α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη (AGP) αποτελεί κύρια πρωτεΐνη οξείαςφάσης που αυξάνεται σημαντικά κατά τη διάρκεια της απόκρισης οξείας φάσης ήσε χρόνιες φλεγμονώδεις αντιδράσεις, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα. Η AGPείναι ένα υπεργλυκοσυλιωμένο μόριο που μπορεί, θεωρητικά, να βρεθεί σε 105διαφορετικές ισομορφές. Έχει δειχθεί ότι η αύξηση της συγκέντρωσης της AGPστον ορό, έπειτα από συστημική χορήγηση καθαρής AGP, οδηγεί σε επιδείνωσητων συμπτωμάτων της αρθρίτιδας σε ΑΑ επίμυς, ενώ η αύξηση των επιπέδων τηςτοπικά στο αρθρικό υγρό των ΑΑ επίμυων, έπειτα από αγωγή με δηλητήριο τηςμέλισσας, συνοδεύεται από πλήρη καταστολή της νόσου. Το σύστημα του ραχιαίουαεροθύλακα προσομοιάζει την άρθρωση αφού περιλαμβάνει μία μεμβράνηπαρόμοια με την αρθρική που συμπεριφέρεται ως φραγμός και μπορεί ναχρησιμοποιηθεί προκειμένου να διερευνηθεί η τοπική δράση της AGP.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να προσδιοριστεί ημικροετερογένεια της σύνθεσης και της γλυκοσυλίωσης της AGP κατά τη διάρκειατης ανάπτυξης της αρθρίτιδας στον ορό του αίματος και το μυελό των οστών σεσύγκριση με την αντίστοιχη απόκριση στον ιστό του αεροθύλακα ως σύστημαπροσομοίωσης της άρθρωσης. Επιπλέον, στόχος είναι: (α) να προσδιοριστεί ορόλος της AGP στο μηχανισμό παθογένειας της αρθρίτιδας στους επίμυς και (β) ναδιερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των κυττάρων, που επιδεικνύουν συγκεκριμένοπρότυπο σύνθεσης των ισομορφών της AGP, στην ανάπτυξη της αρθρίτιδας στουςεπίμυς.Η ανάπτυξη αρθρίτιδας στους επίμυς συνοδεύεται από την μικροετερογένειαστη σύνθεση των διαφόρων ισομορφών της AGP που παρατηρείται στο αίμα και τομυελό των οστών και τη σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων του μυελούτων οστών λόγω της κινητοποίησής τους προς το περιφερικό σύστημα. Τααποτελέσματα αυτής της διατριβής ανέδειξαν την 45 kDa AGP ως την αποκλειστικήεκκρινόμενη ισομορφή κατά τη συστημική απόκριση οξείας φάσης. Αυτή ηισομορφή συντίθεται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος των αρθριτικώνεπίμυων, ενώ δεν συντίθεται από τα κύτταρα του μυελού των οστών. Η σύνθεσητης 45 kDa ισομορφής της AGP από τα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος και ηέκκρισή της στο πλάσμα αυξάνονται πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων τηςαρθρίτιδας. Ο μυελός των οστών των επίμυων επιδεικνύει διφασική σύνθεση της55 kDa ισομορφής της AGP, όπως φαίνεται από τη μείωση των επιπέδων της πριναπό την έναρξη της νόσου και τη σημαντική αύξησή της κατά την ενεργό φάσητης αρθρίτιδας. Η εργασία αυτή ανέδειξε ότι η συστημική αύξηση στη σύνθεση καιέκκριση της 45 kDa AGP ισομορφής σε συνδυασμό με τη μείωση στην τοπικήΠερίληψη160σύνθεση της 55 kDa ισομορφής της AGP στο μυελό των οστών είναι γεγονότα πουπιθανά σχετίζονται με την ομοιοστατική δράση της AGP ή με το μηχανισμόανάπτυξης ΑΑ στους επίμυς. Επιπλέον, η συστημική χορήγηση αντισωμάτωνενάντια στην AGP οδηγεί σε βελτίωση των συμπτωμάτων της αρθρίτιδας, ενώ ησυστημική υπερέκφραση της 45 kDa ισομορφής παρουσιάζει διπλήανοσοτροποποιητική δράση αφού επιταχύνει την έναρξη και επιτείνει τη βαρύτητατης νόσου, ενώ δεν επιτρέπει την παραμόρφωση της άρθρωσης.Τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής επιβεβαιώνουν όλα τα μορφολογικάστοιχεία που δείχνουν ομοιότητα ανάμεσα στην άρθρωση και το σύστημα τουαεροθύλακα. Επιπλέον, δείχνουν ότι το FCA στον αεροθύλακα ενεργοποιεί, όπωςκαι στην άρθρωση των ΑΑ επίμυων, την παραγωγή ανοσορυθμιστικών προϊόντων,όπως παράγοντες της φλεγμονής (COX-1, COX-2), κυτοκίνες (IFNγ, IL-8, TNFα)και υποδοχείς (TLRs). Στο σύστημα του αεροθύλακα μετά από χορήγηση FCA,παρατηρείται διαφορική ενεργοποίηση της σύνθεσης της AGP, καθώς η μεμβράνητου αεροθύλακα παράγει κυρίως τη 45 kDa ισομορφή, ενώ τα πολυμορφοπύρηνακύτταρα που τη διηθούν εκκρίνουν βασικά τις υψηλού μοριακού βάρουςισομορφές. Η 55 kDa ισομορφή της AGP δεν εκκρίνεται στο εξίδρωμα τουαεροθύλακα αμέσως μετά τη χορήγηση του FCA. Η κυτταρική θεραπεία με τοπικήχορήγηση φυσιολογικών κοκκιοκυττάρων του μυελού των οστών που παράγουντην 55 kDa ισομορφή της AGP ή πολυμορφοπύρηνων κυττάρων πουσυσσωρεύονται στον αεροθύλακα που παράγουν τόσο την 55 kDa όσο και την 45kDa ισομορφή της AGP, οδηγεί σε ύφεση των συμπτωμάτων της αρθρίτιδας. H 50kDa ισομορφή της AGP εκκρίνεται κυρίως από τα κύτταρα της μεμβράνης τουαεροθύλακα και πιθανά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων της μεμβράνης,δρώντας ως αντιφλεγμονώδες μόριο αναστολής της εξαγγείωσης των κυττάρων.Συμπερασματικά, αυτή η έρευνα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν τη διπλήανοσοτροποποιητική δράση της AGP που εξαρτάται τόσο από το μικροπεριβάλλονστο οποίο παράγεται όσο και τη μετα-μεταφραστική της γλυκοσυλίωση, γεγονόςπου την καθιστά υποψήφια για εφαρμογή θεραπευτικών σχημάτων πουπεριλαμβάνουν γονιδιακή, κυτταρική ή κυτταρική/γονιδιακή θεραπεία