Διερεύνηση της επίδρασης της ρουπαταδίνης στην έκφραση φλεγμονογόνων και φλεγμονολυτικών παραγόντων στον κερατοειδή του κονίκλου, μετά από οξεία έκθεση σε τεχνητό ηλιακό φως

Abstract

Acute exposure of ocular tissues to natural or artificial light can induce inflammatory responses such as photokeratitis, anterior uveitis and conjunctivitis, attributed mainly to the UVB range of the spectrum. In this dissertation, a model of acute exposure of rabbit eyes to artificial sunlight was used in order to study possible alterations in the architecture of corneal and conjunctival tissue as well as in the expression of selected genes related to the inflammatory response. The effect of topical application of rupatadine, a dual H1 histamine receptor/ platelet activating factor receptor (PAFR) antagonist, was also tested in the same system. New Zealand albino rabbits were immobilized opposite a 300W Osram Ultra-Vitalux® light bulb with an emission radiation spectrum similar to that of normal sunlight at noon, and exposed for 30 min to an equivalent of 7,500 Jm-1 of UVB irradiation, in the range of the reported threshold for corneal damage. Corneal and third eyelid tissue samples were removed from exposed eyes at 2, 6 and 24 hours following the end of the exposure to the bulb light, and were subsequently processed for histochemical staining and RNA extraction. The gene expression of tumor necrosis factor (TNF), interleukin 6 (IL-6), PAFR, cyclooxygenase-2 (COX2), and lipoxygenase-12 (ALOX12), was monitored with conventional RT-PCR. Rupatadine fumarate, dissolved in DMSO, was applied topically in concentrations similar to those routinely used in ocular preparations of other antihistamines, 2 hours before, and immediately after, exposure. Only minor alterations were detected, using standard eosin-hematoxylin staining, in corneal tissue, as a result of acute exposure to artificial sunlight. In the third eyelid conjunctiva however, a marked accumulation of eosinophils was noticed, as early as hour 2 post-exposure, which appears to be directed towards the upper part of the epithelial layer. This effect appears to subside by hour 24. No statistically significant changes were detected with respect to the gene expression examined, with the single exception of an increase in COX2 expression at hour 2 post-exposure, in corneal tissue. Topical administration of rupatadine did not affect the eosinophil accumulation in the conjunctiva, at hour 2 post-exposure. At the same time point, the gene expression of PAFR, but not that of TNF or IL6, was marginally decreased as a result of topical rupatadine administration in corneal and conjunctival tissue.

Η οξεία έκθεση των οφθαλμικών ιστών στο φυσικό ή το τεχνητό φως είναι δυνατόν να προκαλέσει φλεγμονώδεις απαντήσεις όπως η φωτοκερατίτιδα, η φωτοεπιπεφυκίτιδα και η πρόσθια ραγοειδίτιδα. Οι βλάβες αυτές αποδίδονται κυρίως στην υπεριώδη ακτινοβολία τύπου Β (UVB). Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο οξείας έκθεσης των οφθαλμών του κονίκλου σε τεχνητό ηλιακό φως, ώστε να μελετηθεί η πιθανή επαγωγή μεταβολών στην αρχιτεκτονική του κερατοειδή χιτώνα και του επιπεφυκότα, όπως και η έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την φλεγμονώδη απάντηση. Ακόμη μελετήθηκε η επίδραση της τοπικής εφαρμογής της ρουπαταδίνης, ενός αντιισταμινικού φαρμάκου και ανταγωνιστή του υποδοχέα του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAFR). Κόνικλοι New Zealand albino ακινητοποιήθηκαν απέναντι από μια λυχνία 300W Osram Ultra-Vitalux® η οποία έχει φάσμα εκπομπής παρόμοιο με αυτό του ηλιακού φωτός και εκτέθηκαν για 30 min σε UVB ακτινοβολία 7,500 Jm-1, στην περιοχή του αναφερόμενου ουδού έκθεσης για την πρόκληση βλάβης στον κερατοειδή χιτώνα. Τεμάχια κερατοειδούς και τρίτου βλέφαρου αφαιρέθηκαν από οφθαλμούς κονίκλων οι οποίοι είχαν εκτεθεί στην ακτινοβολία, 2, 6 και 24 ώρες μετά την έκθεση και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία κατάλληλη για ιστοχημική χρώση και απομόνωση RNA. Η έκφραση γονιδίου του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF), της ιντερλευκίνης 6 (IL-6), του PAFR, της κυκλοοξυγονάσης 2 (COX2) και της λιποοξυγονάσης 12 (ALOX12) προσδιορίστηκε με συμβατική RT-PCR. Διάλυμα φουμαρικής ρουπαταδίνης σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), εφαρμόστηκε τοπικά στους οφθαλμούς των κονίκλων σε συγκέντρωση 0,1%, παρόμοια με αυτήν που χρησιμοποιείται σε οφθαλμικά σκευάσματα αντιισταμινικών σε κλινική χρήση, 2 ώρες πριν και μετά την έκθεση στην ακτινοβολία. Στον κερατοειδή ανιχνεύτηκαν, με κλασική χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης, μόνον περιορισμένες μεταβολές ως αποτέλεσμα της οξεάις έκθεσης στο τεχνητό φως. Αντίθετα, στον επιπεφυκότα του τρίτου βλέφαρου παρατηρήθηκε ήδη από την δεύτερη ώρα μετά την έκθεση στην ακτινοβολία, κυτταρική διήθηση από ηωσινόφιλα πολυμορφοπύρηνα, κατευθυνόμενη προς το άνω τμήμα της επιθηλιακής στιβάδας, η οποία φαίνεται να έχει υποχωρήσει κατά την 24η ώρα μετά την έκθεση. Σε ότι αφορά την έκφραση των γονιδίων που μελετήθηκαν, δεν ανιχνεύτηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, με μόνη διαφορά την αύξηση της έκφρασης του COX2 που παρατηρήθηκε στον κερατοειδή χιτώνα κατά την δεύτερη ώρα μετά την έκθεση στην ακτινοβολία. Η τοπική εφαρμογή της ρουπαταδίνης στους οφθαλμούς δεν επηρέασε τη διήθηση των ηωσινόφιλων στην επιθηλιακή στιβάδα του επιπεφυκότα του τρίτου βλέφαρου που παρατηρήθηκε κατά τη δεύτερη ώρα μετά την έκθεση στην ακτινοβολία. Από τα γονίδια που μελετήθηκαν, μόνον η έκφραση γονιδίου του PAFR ελαττώθηκε οριακά, στον κερατοειδή και το τρίτο βλέφαρο, ως αποτέλεσμα της τοπικής εφαρμογής της ρουπαταδίνης.