Ο ρόλος των μοριακών δεικτών DEK, SURVIVIN, P33ING1, MMP-2, C-ERBB-2 στην πρόγνωση του ουροθηλιακού καρκινώματος της ουροδόχου κύστεως

Abstract

Urothelial bladder cancer is the second most common genitourinary tumor and constitutes an important cause of morbidity and mortality. It presents a meaningful heterogeneity in biological behaviour that is not completely understood. It is well known that two morphologically similar tumors presenting in any assigned stage may behave in different fashions, a fact that seriously impedes the potential to accurately predict the clinical outcome in a given case. The ability to designate those superficial tumors with an adverse disease outcome and those unlikely to become invasive or clinically threatening, would be of great clinical benefit. Superficial tumors that maintain a more malignant phenotype may be better treated with early aggressive therapy. In our study archival tumor tissue from 80 patients with urothelial carcinoma were analysed by immunohistochemistry. The aim of this study was to investigate the expression pattern of survivin, c-erbB-2, DEK, MMP-2 and P33ING1 in order to determine their potential prognostic significance. Since its discovery in 1997, survivin has garnered significant interest due to its putative role as an inhibitor of apoptosis. Few studies have investigated the immunohistochemical status of survivin in urothelial bladder carcinoma. The subcellular localization of survivin (nuclear, cytoplasmic) and its differential predictive value is a parameter that previous studies have almost ignored. In our study nuclear and cytoplasmic positive scores of 61.25% (49/80) and 22.5% (18/80), respectively were found. Nuclear positive staining correlated strongly with increased grade (p=0.001), stage (p= 0.039) and the probability of tumor recurrence (p=0.029). No relationship was found between the cytoplasmic survivin level and the clinicopathological parameters. Nuclear expression was identified as a significant independent predictor of relapse-free survival (p=0.016). The HER2/neu protein was overexpressed in 41 of 80 patients (51,25%), demonstrating an increase in the expression rate corresponding to the advancement of tumor grade (p=0,0001) and tumor stage (p=0,032). Kaplan Meier analyses showed that positive membranous expression of HER2/neu was not associated with an increased probability of tumor recurrence (p=0,362). Contrarily, the HER2 scores correlated strongly with specific survival probability (p=0,002) and overall survival (p=0,025) analyzing all patients. The multivariate analysis revealed that only stage was an independent predictor of specific survival. (p=0,016). The HER2 expression was an independent predictor of specific survival with borderline statistical significance (p=0,08). High DEK protein expression was found in 51/80 tumors and was significantly associated with tumor invasiveness and tumor grade (p=0.016 and p=0.001, respectively). Kaplan Meier analyses showed that positive nuclear expression of DEK was associated with an increased probability of tumor recurrence with borderline statistical significance (p=0.055). DEK scores did not correlated with overall survival (p=0.429) and specific survival (p=0.323) analyzing all patients. Only tumor stage correlated strongly with overall survival (p=0.002) and specific survival (p=0.0001). Positive MMP-2 expression was found in 35/80 tumors. The staining was granular and was localized in cytoplasm. No relationship was found between the cytoplasmic MMP-2 level and the clinicopathological parameters. MMP-2 scores did not correlated with disease-free, overall or specific survival. Positive P33ING1 expression was found in 19/56 tumors. No relationship was found between the nuclear P33ING1 expression and the clinicopathological variables. We propose that survivin is a potential molecular marker for prediction of bladder cancer’s behavior. Our data corroborate the findings of other studies that HER-2 overexpression is high in patients with advanced bladder cancer and influences the outcome of these patients, thereby suggesting that HER-2 is a potential target for treatment of this cancer. Our findings indicate that DEK may contribute to the development of advanced bladder cancer. These conclusions have to receive further validation in larger prospective series.

Το ουροθηλιακό καρκίνωμα είναι ο δεύτερος πιο συχνός όγκος του ουροποιογεννητικού συστήματος και σημαντική αιτία θνησιμότητας και θνητότητας. Εμφανίζει αξιοσημείωτη ετερογένεια στη βιολογική συμπεριφορά. Δύο μορφολογικά όμοιοι όγκοι που εμφανίζονται σε ένα συγκεκριμένο στάδιο είναι δυνατό να εμφανίσουν διαφορετική εξέλιξη γεγονός που περιορίζει τη δυνατότητα πρόβλεψης της κλινικής πορείας σε μια δεδομένη περίπτωση. Στη παρούσα μελέτη διερευνήθηκε το ανοσοϊστοχημικό προφίλ των δεικτών survivin, c-erbB-2, DEK, MMP-2 και P33ing1 και προσδιορίστηκε η προγνωστική τους αξία σε σχέση με την υποτροπή και επιβίωση. Survivin: Βρέθηκε θετική πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση σε ποσοστό 61,25% (49/80) και 22,5% (18/80), αντιστοίχως. Παρατηρήσαμε μια επικρατούσα πυρηνική χρώση σε 49 περιστατικά και μια αμυδρή διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση σε 18 περιστατικά. Σε 13 περιπτώσεις παρατηρήθηκε ταυτόχρονη πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση. Δεν παρατηρήθηκε στατιστική συσχέτιση της κυτταροπλασματικής έκφρασης και των κλινικοπαθο-λογοανατομικών παραμέτρων. Αντίθετα, η πυρηνική έκφραση της Σαρβιβίνης εμφάνισε δυνατή στατιστική συσχέτιση με το βαθμό πυρηνικής ανάπλασης (grade) (P=0,001) και το στάδιο της νόσου (P=0,039) όπως καθορίστηκε με το Chi-square τεστ. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan Meier έδειξαν στατιστική συσχέτιση της θετικής πυρηνικής έκφρασης με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου (P=0,029). Ο βαθμός έκφρασης της Σαρβιβίνης δε βρέθηκε να συνδέεται με την ολική επιβίωση των ασθενών (P=0,854). Η πολυπαραγοντική ανάλυση κατά Cox αποκάλυψε ότι η πυρηνική έκφραση της Σαρβιβίνης ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της ελεύθερης νόσου επιβίωσης (P=0,016).C-erbB-2: Με βάση το υιοθετούμενο σύστημα βαθμονόμησης, βρέθηκε υπερέκφραση της κυτταρικής μεμβράνης (βαθμός 2,3) στο 51,25% των περιπτώσεων (41/80). Παρατηρήθηκε μια έντονη χρώση της κυτταρικής μεμβράνης σε 51 περιπτώσεις (βαθμός 1,2,3). Μία ασθενής διάχυτη χρώση του κυτταροπλασμάτος αναγνωρίστηκε σε όλο το φάσμα των τομών, πιθανώς οφειλόμενη σε αντίδραση του αντισώματος με διάφορους αντιγονικούς καθοριστές (epitopes) της περιοχής του κυτταροπλάσματος. Κατά τη στατιστική ανάλυση, η παράμετρος της έκφρασης διχοτομήθηκε σε δύο υποομάδες. Αρνητική έκφραση (βαθμός 0, 1+) και θετική έκφραση (βαθμός 2+, 3+). Η μεμβρανική χρώση εμφάνισε ισχυρή στατιστική συσχέτιση με το βαθμό πυρηνικής ανάπλασης (grade) (P=0,0001) και το στάδιο της νόσου (P=0,032), όπως ανέδειξε η chi-square δοκιμασία. Οι καμπύλες Kaplan Meier δεν κατέδειξαν στατιστική συσχέτιση της μεμβρανικής χρώσης με αυξημένη υποτροπή της νόσου. (P=0,362). Αντιθέτως, ανέδειξαν ισχυρή σχέση με την ολική (P=0,025) και ειδική (P=0,002) επιβίωση. Ακολούθησε πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, σύμφωνα με το μοντέλο αναλογικού κινδύνου κατά Cox, προκειμένου να βρεθούν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της επιβίωσης. Βρέθηκε ότι μόνο το στάδιο αποτελεί ανέξαρτητο προγνωστικό δείκτη της ειδικής επιβίωσης (P=0,016), ενώ η έκφραση της HER2 ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της ειδικής επιβίωσης εμφάνισε οριακή στατιστική σημαντικότητα (P=0,08).DEK: Με βάση το σύστημα βαθμονόμησης, βρέθηκε θετική πυρηνική χρώση στο 63,75% (51/80). Πρωταρχικά, βρέθηκε μια αύξηση στο ποσοστό της θετικής έκφρασης ανάλογη με τη βαθμιαία αύξηση του σταδίου της νόσου (PTa:47%, PT1:60%, PT2:82%, PT2:100%) (πίνακας 8). Το μοντέλο ανοσοέκφρασης της πρωτεΐνης DEK απεικονίζεται στην εικόνα 12 και συνίσταται σε μια ξεκάθαρη προεξάρχουσα πυρηνική χρώση. Μία διάχυτη ασθενής κυτταροπλασματική χρώση παρατηρήθηκε σε κάποια καρκινικά κύτταρα και μερικώς στον περιβάλλοντα βλεννογόνο. Δε καταφέραμε να αναδείξουμε καμία συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης και των κλινικοπαθολογικών παραμέτρων. Αντίθετα, η πυρηνική χρώση εμφάνισε ισχυρή συσχέτιση με το βαθμό πυρηνικής διαφοροποίησης (grade) (P=0,0001) και το στάδιο της νόσου (stage) (P= 0,016), όπως καθορίστηκε με τη chi-square δοκιμασία. Η αξιολόγηση των καμπυλών επιβίωσης μεταξύ των δύο ομάδων ( θετική – αρνητική έκφραση) βασίσθηκε στη δοκιμασία log-rank και η γραφική αναπαράστασή τους έγινε με βάση τη μέθοδο Kaplan Meier . Η ομάδα των ασθενών με θετική πυρηνική έκφραση εμφάνισε αυξημένη πιθανότητα για υποτροπή της νόσου με οριακή στατιστική σημαντικότητα (P=0,055) (εικόνα 12A). Ξεκάθαρα, δεν καταφέραμε να αναδείξουμε συσχέτιση της ανοσοχρώσης με την ολική (P=0,429) (figure 2B) και ειδική επιβίωση (P=0,323) (figure 2C) . Μόνο η παράμετρος του σταδίου εμφάνισε ισχυρή συσχέτιση με την ολική και ειδική επιβίωση (P=0,002) , (P=0,0001) αντίστοιχα.MMP-2: Υπερέκφραση της πρωτεΐνης, με τη μορφή κοκκιώδους κυτταροπλασματικής χρώσης παρατηρήθηκε στο 43,75% (35/80) των περιπτώσεων. Καμία συσχέτιση δε βρέθηκε ανάμεσα στην κυτταροπλασματική έκφραση της ΜΜP-2 και τις κλινικο-ιστολογικές παραμέτρους (φύλο, ηλικία, μέγεθος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης, στάδιο νόσου). Η ανοσοέκφραση δεν αναγνωρίστηκε ως προγνωστικός δείκτης καθώς καμία στατιστικά σημαντική σχέση δε βρέθηκε με την ελεύθερη νόσου επιβίωση, την ειδική και ολική επιβίωση. P33ING1: Το μονοκλωνικό αντίσωμα P33ING1b (1:100, Cab 9, mouse monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σε νεοπλασματικό ιστό ουροδόχου κύστης. Θετική πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε σε 19 περιπτώσεις . Αρνητική χρώση βρέθηκε σε 37 περιπτώσεις ενώ σε ένα μεγάλο αριθμό πλακιδίων η χρώση θεωρήθηκε μη ειδική (24 περιπτώσεις) λόγω του εκτεταμένου υποστρώματος. Καμία συσχέτιση δε βρέθηκε ανάμεσα στην πυρηνική έκφραση του P33ING1 και στις κλινικο-ιστολογικές παραμέτρους (φύλο, ηλικία, μέγεθος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης, στάδιο νόσου) στα εναπομείναντα 56 περιστατικά