Πρόληψη της ανάπτυξης εξάρτησης από τη μορφίνη έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης RGS9 στον εγκέφαλο

Abstract

Μέχρι σήμερα τα οπιοειδή παραμένουν τα φάρμακα με την ισχυρότερη αναλγητική ανταπόκριση σε αρκετές μορφές πόνου. Ένα από τα μεγαλύτερα κλινικά αλλά και κοινωνικά προβλήματα στην αντιμετώπιση του χρόνιου πόνου είναι η ανάπτυξη εξάρτησης από τα οπιοειδή σε ασθενείς που χρειάζονται χρόνια αναλγητική θεραπεία και η εμφάνιση στερητικού συνδρόμου μετά την απότομη διακοπή χορήγησης τους. Πέραν όμως από το πρόβλημα της εξάρτησης στην χρόνια λήψη οπιοειδών, οι ασθενείς παρουσιάζουν και μείωση της αναλγητικής τους ανταπόκρισης, λόγω ανάπτυξης ανοχής στην χορηγούμενη δόση μορφίνης. Η ανοχή οδηγεί σε συνεχή αύξηση της δοσολογίας του φαρμάκου, προκειμένου να επιτευχθεί το αναμενόμενο αναλγητικό αποτέλεσμα, με συνέπεια, την ανάπτυξη εξάρτησης στην ουσία και την εμφάνιση σοβαρών παρενεργειών τόσο στο ΚΝΣ, όσο και σε περιφερικούς ιστούς. Όλα αυτά, καθιστούν την χορήγηση της μορφίνης, καθώς και άλλων οπιοειδών φαρμάκων προβληματική, σε ασθενείς που θα την είχαν ανάγκη για μεγάλο χρονικό διάστημα καθώς και περιορισμένη κυρίως σε κλινικές οντότητες με χαμηλό προσδόκιμο ζωής ή τελικού σταδίου νόσου (πχ καρκινοπαθείς). Οι αλλαγές αυτές της δράσης της μορφίνης στον οργανισμό είναι αποτέλεσμα προσαρμοστικών μεταβολών που συμβαίνουν σε κυτταρικό επίπεδο και σε συγκεκριμένα νευρωνικά υποστρώματα. Οι ακριβείς μηχανισμοί αυτών των μεταβολών δεν είναι απολύτως διευκρινισμένοι και πιθανώς συμπεριλαμβάνουν τροποποιήσεις σε πολλαπλά νευρωνικά δίκτυα και στην έκφραση μεγάλου αριθμού γονιδίων, άρα και πρωτεϊνών. Για τον λόγο αυτό, είναι σημαντική η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στους προσαρμοστικούς μηχανισμούς που οδηγούν στην ανάπτυξη ανοχής και εξάρτησης του οργανισμού στην μορφίνη. Μία ομάδα πρωτεϊνών που συμβάλει στους προσαρμοστικούς μηχανισμούς της χρόνιας χορήγησης μορφίνης στον οργανισμό είναι η οικογένεια των RGS πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες αυτές ρυθμίζουν την ένταση και διάρκεια της δραστικότητας των G πρωτεϊνών, ρυθμίζοντας έτσι έμμεσα το εύρος σηματοδότησης των υποδοχέων που είναι προσδεδεμένοι με τις G πρωτεΐνες. Οι RGS πρωτεΐνες παίζουν ρόλο σε πολλές χρόνιες ασθένειες, όπως η σχιζοφρένεια, η κατάθλιψη και η εξάρτηση στις ουσίες. Συγκεκριμένα, μια σειρά πρόσφατων μελετών, συνδέει την πρωτεΐνη RGS9-2 με την εξάρτηση. Η RGS9-2, η οποία παρουσιάζει πλούσια έκφραση στο κέντρο εθισμού, ρυθμίζει την διάρκεια ενεργοποίησης της άλφα υπομονάδας των G πρωτεϊνών, μέσω κατάλυσης της επανασύνδεσης των α και βγ υπομονάδων της, άρα και την λήξη σηματοδότησης του υποδοχέα. Πολλαπλές in vitro και in vivo μελέτες έδειξαν ότι η RGS9-2 ρυθμίζει δυναμικά την ανταπόκριση των μ-οπιοειδών υποδοχέων (MOR) και παίζει σημαντικό ρόλο στις δράσεις της μορφίνης ενώ επίσης προάγει την ευαισθητοποίηση στις ανταμοιβικές ιδιότητες των οπιοειδών και ψυχοδιεγερτικών ουσιών (Burns&Wensel 2003, Rahman et al 2003, Zachariou et al 2003, Psifogeorgou et al. 2007& 2010). Πιο συγκεκριμένα, προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας σε διαγονιδιακά ζώα, με καθολική απαλοιφή του γονιδίου της RGS9, έδειξαν ότι τα ζώα αυτά εμφανίζουν αυξημένη συμπεριφορική ευαισθησία στην ανταμοιβική δράση της μορφίνης, σε σχέση με τα αγρίου τύπου ζώα, αναλγητική ανταπόκριση σε πολύ χαμηλότερες δόσεις από αυτές που χρειάζονταν τα αγρίου τύπου, καθώς και καθυστέρηση στην ανάπτυξη ανοχής (Zachariou et al 2003). Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι επέμβαση στη δράση της RGS9-2, επηρεάζει δυναμικά τις δράσεις της μορφίνης στο ΚΝΣ και καθιστούν το μόριο αυτό, σημαντικό φαρμακολογικό στόχο. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να διερευνηθούν οι επιδράσεις της στοχευμένης τροποποίησης των επίπεδων της RGS9-2 σε ειδικούς πυρήνες του εγκεφάλου, όπου εμφανίζει πλούσια κατανομή. Το ραχιαίο ραβδωτό και ιδίως ο επικλινής πυρήνας (κοιλιακό ραβδωτό), αποτελούν τους σημαντικότερους πυρήνες στο παθοφυσιολογικό και φαρμακολογικό μονοπάτι του εθισμού, αφού ρυθμίζουν τις ενισχυτικές και εξαρτησιογόνες δράσεις των οπιοειδών έπειτα απο διέγερση των μ-οπιοειδών υποδοχέων και εμφανίζουν τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτείνης στον εγκέφαλο. Πέραν των ανωτέρω περιοχών όμως, αρκετά υψηλά επίπεδα έκφρασης της RGS9-2 πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί και στα οπίσθια κέρατα του νωτιαίου μυελού, που όπως είναι γνωστό, αποτελούν σημαντικές περιοχές νευροδιαβίβασης των επώδυνων ερεθισμάτων, καθώς και στόχο αρκετών αναλγητικών φαρμάκων όπως τα οπιοειδή. Όλες οι προαναφερόμενες περιοχές εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα την RGS9-2. Με στόχο την διερεύνηση του ρόλου της RGS9-2 στις συγκεκριμένες περιοχές του ΚΝΣ, δημιουργήθηκαν γενετικά μοντέλα υπερέκφρασης της. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν AAV ιϊκά οχήματα αδενοσυσχετιζόμενων ιών (adeno associated virus) τα οποία εγχύθηκαν μέσω στερεοταξικής επέμβασης σε επιλεγμένες περιοχές του εγκεφάλου. Οι ιοί που χρησιμοποιούνται στην συγκεκριμένη διατριβή υπερεκφράζουν την RGS9-2 ή την μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης η οποία έχει dominant negative δράση. Συγκεκριμένα, οι ιοί που κατασκευάστηκαν, φέρουν είτε την RGS9-2 σεσημασμένη με GFP, είτε την μεταλλαγμένη μορφή της RGS9-2 DEPless (η RGS9-2 πρωτεΐνη χωρίς το DEP domain της, το οποίο της προσδίδει την ικανότητα πρόσδεσης της στην κυτταρική μεμβράνη, άρα και την δημιουργία σταθερών συμπλόκων κοντά σ' αυτήν) σεσημασμένη με GFP, με στόχο την υπερέκφραση των πρωτεϊνών αυτών στις περιοχές του εγκεφάλου που διοχετεύεται ο ιός. Προ έναρξης ευρείας χρήσης των AAV οχημάτων σε συμπεριφορικές μελέτες έγινε αρχικά ταυτοποίηση του ποσοστού υπερέκφρασης και της κατανομής του ιού στην περιοχή έγχυσης καθώς και στα νευρικά κύτταρα στα οποία εκφράζεται ο ιός υπερέκφρασης της RGS9-2. Μελέτες που έγιναν σε πρωτογενείς κυτταρικές σειρές, δείχνουν ότι η παρουσία της μεταλλαγμένης RGS9-2 (RGS9-2-DEPless) παίζει dominant negative ρόλο (Psifogeorgou et al. 2007), ανταγωνίζεται δηλαδή την δράση της ενδογενούς RGS9-2 πρωτεΐνης σχηματίζοντας σύμπλοκα με τα σηματοδοτικά της μόρια μακριά από την κυτταρική μεμβράνη - λόγω έλλειψης του DEP τμήματος από την κυτταρική δομή της RGS9-2 πρωτεΐνης (Kassi Psifogeorgiou 2007). Επίσης κατασκευάστηκε ιός ο οποίος έφερε μόνο το γονίδιο της EGFP για την παραγωγή της ομάδας των ποντικών μαρτύρων. Στην συνέχεια μελετήθηκαν οι επιπτώσεις της υπερέκφρασης ή ανταγωνισμού δράσης της RGS9-2 στις συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, στην συμπεριφορά των ζώων μετά από εφάπαξ ή χρόνια χορήγηση μορφίνης, μέσω ευρέως γνωστών συμπεριφορικών παραδειγμάτων αξιολόγησης της εξάρτησης, ανταμοιβής, ανοχής και αναλγησίας στην μορφίνη. Μέσω αυτών διαπιστώθηκε: 1) η σπουδαιότητα της δράσης της RGS9-2 στον επικλινή πυρήνα και στους μηχανισμούς ανάπτυξης εθισμού, αναλγησίας και ανοχής στα οπιοειδή, 2) η σπουδαιότητα της δράσης της RGS9-2 στο ραχιαίο ραβδωτό και στους μηχανισμούς εθισμού, αναλγησίας και ανοχής στα οπιοειδή, 3) η περαιτέρω σχέση των πυρήνων αυτών με τον εθισμό και την αναλγησία, καθώς και 4) ο ρόλος της RGS9-2 στα οπίσθια κέρατα του νωτιαίου μυελού στις αναλγητικές δράσεις της μορφίνης.