Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός της απόπτωσης και ποσοτική εκτίμηση αυτής σε νεκροτομικό υλικό μυοκαρδίου

Abstract

OBJECTIVES: Significant progress has been made in demonstrating the role of apoptosis in various heart diseases, and in elucidating the molecular mechanisms of cardiac apoptosis. The progressive loss of cardiac myocytes is one of the most important pathogenic components of the heart failure. Even though the rate of apoptosis in heart failure is relatively low in absolute numbers, it is significantly higher than that in the normal heart, which has essentially negligible baseline apoptosis. Recently, animal models of heart failure incorporating transgenic technology have confirmed that myocyte apoptosis itself is sufficient to induce heart failure. The importance of apoptosis in cardiovascular system is also becoming increasingly clear, and the inhibition of apoptosis is emerging as a potential therapeutic tool for various forms of cardiovascular disease. The purpose of this study was to investigate the presence of apoptosis-related proteins p53, bax, bak, bcl-2 in dilated cardiomyopathy and in ischemic cardiac disorders.METHODS: We studied myocardial samples from 40 hearts with histologic findings of acute myocardial infraction (Group A1), 40 hearts with old myocardial infraction (Group A2), and 40 hearts with dilated cardiomyopathy. Myocardial samples from 30 normal hearts were used as control group. An immunohistochemical method was performed with the use of p53, bax, bak, bcl-2 and bcl-xl antibodies.RESULTS: Immunohistochemistry of proapoptotic proteins (p53, bax, bak) and antiapoptotic proteins (Bcl-2, bcl-xl) demonstrated higher levels of these proteins in dilated cardiomyopathy as compared with normal hearts. The diseased group had a larger number of samples with strong p53, bax, bak, staining (50%, 58%, 55%, respectively) as compared with the control group, in which demonstrated weak p53 staining (46%, 50%, 43%, respectively). Bcl-2 and bcl-xl immunostaining in the positive samples of the diseased group was generally weak (70%, 68%, respectively) and negative in the control group (60%, 65%, respectively). Furthermore, antiapoptotic proteins (Bcl-2, bcl-xl) are induced in salvaged myocytes surrounding infracted areas in the regions at risk in acute stage of infraction. Bcl-2 positive myocytes were not seen in the infracted myocytes in the heart with acute infraction. Bcl-2 and bcl-xl immunostaining in salvaged myocytes of163hearts with old infraction was generally weak. Bcl-2 positive immunoreactivity was not evident in normal hearts. Proapoptotic protein expression (p53, bax, bak) was rare in salvaged myocytes within the risk area at the acute stage of infraction. P53, bax and bak positive immunoreactivity was evident in the infracted myocytes. Proapoptotic proteins are induced in salvaged myocytes at the old stage of infraction. P53 positive immunoreactivity of normal control heart tissue was slight in most of myocytes. Myocytes exposed to various stress, such as chronic ischemia (salvaged myocytes at the old stage of infraction) induced the overexpression of proapoptotic proteins.CONCLUSIONS: The elevated presence of p53, bax and bak -positive cells in dilated cardiomyopathy is associated with progressive loss of myocytes in heart failure. On the other hand, increased expression of the antiapoptotic protein bcl-2 in human myocardium with dilated cardiomyopathy may be a compensation for the loss of myocytes and a possible compensatory antiapoptotic mechanism in the diseased group. Furthermore, the elevated expression of proapoptotic proteins is associated with the progressive loss of myocytes by apoptosis and may play a role in the evolution of the chronic heart failure in patients with old myocardial infraction and chronic ischemic disease. The increased expression of antiapoptotic proteins in acute myocardial infraction represents a possible compensatory mechanism of salvaged myocytes. The prevalence of the apoptotic mechanism or this of compensatory antiapoptotic may influence the evolution of heart failure in heart diseases.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ : Σημαντική εξέλιξη έχει επιτευχθεί, τα τελευταία χρόνια, στον καθορισμό του ρόλου της απόπτωσης στις καρδιαγγειακές παθήσεις καθώς και στη διαλεύκανση των αποπτωτικών μοριακών μηχανισμών στα μυοκαρδιακά κύτταρα. Η βαθμιαία και σταθερή απώλεια των μυοκαρδιακών κυττάρων αποτελεί σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα της καρδιακής ανεπάρκειας. Η διερεύνηση της απόπτωσης στο καρδιαγγειακό σύστημα είναι ύψιστης σημασίας, αφού η παρεμπόδιση της αποπτωτικής διαδικασίας μπορεί να αποτελέσει βασικό θεραπευτικό εργαλείο στην αντιμετώπιση διάφορων καρδιαγγειακών παθήσεων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση και ανάδειξη των αποπτωτικών μηχανισμών σε περιπτώσεις εμφράγματος του μυοκαρδίου και διατατικής μυοκαρδιοπάθειας και ο συσχετισμός τους με την καρδιακή λειτουργία.ΥΛΙΚΟ – ΜΕΘΟΔΟΙ: Μελετήθηκαν 40 περιπτώσεις νεκροτομικού υλικού μυοκαρδίου με αλλοιώσεις προσφάτου εμφράγματος (ομάδα Α1), 40 περιπτώσεις με αλλοιώσεις παλαιού εμφράγματος (ομάδα A2), 40 περιπτώσεις με αλλοιώσεις διατατικής μυοκαρδιοπάθειας (ομάδα B) και 30 περιπτώσεις μάρτυρες όπου είχε αποκλεισθεί η ύπαρξη καρδιακής νόσου (ομάδα Γ). Όλες οι περιπτώσεις εξετάσθηκαν με τη συμβατική παθολογοανατομική μέθοδο σε τομές παραφίνης και με χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης. Επιπλέον εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος δύο βημάτων με τη χρήση των αντισωμάτων Bax (Polyclonal Rabbit, Dako, Denmark), αραίωση 1:500, Bak (Polyclonal Rabbit, Dako, Denmark), αραίωση 1:100, Bcl-xL (clone NC1 FP, Novocastra, Newcastle, upon Tyne, U.K), αραίωση 1:50, Bcl-2 (clone 100/D5) (Dakopatts, Glostrup, Denmark), αραίωση 1:50, p53 (clone DO-7, Dakopatts, Glostrup, Denmark), αραίωση 1:100. Η ανοσοïστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών p53, bcl-2, bclxL, Bax, Bak ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος Histoscore (HSC), που κυμαινόταν από 0 έως 12 βαθμούς, και υπολογίστηκε από το γινόμενο του βαθμού του ποσοστού θετικών κυττάρων (0-5%=0, 5-25%=1, 26-50%=2, 51-75%=3 και 76-100%=4) με το βαθμό της έντασης της χρώσης (1=ήπια, 2=μέτρια και 3=έντονη ανοσοέκφραση).160ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα περισσότερα δείγματα διατατικής μυοκαρδιοπάθειας παρουσίασαν έντονη ανοσοέκφραση για το p53 (50% των δειγμάτων) συγκριτικά με τους μάρτυρες στους οποίους υπήρχε ήπια ανοσοέκφραση p53 (46% των δειγμάτων). Η ανοσοέκφραση για bcl-2, bclxL, Bax, Bak ήταν πιο ομοιογενής. Τα περισσότερα δείγματα διατατικής μυοκαρδιοπάθειας παρουσίασαν έντονη ανοσοέκφραση για τα Bax, Bak (58%-55% των δειγμάτων, αντίστοιχα) συγκριτικά με τους μάρτυρες στους οποίους υπήρχε ήπια ανοσοέκφραση Bax, Bak (50%-43% των δειγμάτων, αντίστοιχα) Ήπια ανοσοέκφραση για bcl-2 και bclxL παρατηρήθηκε στο 70% και 68% αντίστοιχα των περιπτώσεων της διατατικής μυοκαρδιοπάθειας, ενώ παρατηρήθηκε αρνητική έκφραση στο 60%-65% αντίστοιχα των μαρτύρων. Η ανοσοχρώση για bcl-2 και bclxL γενικά ήταν ήπια και ομοιογενής στη διατατική μυοκαρδιοπάθεια, όπως και στους μάρτυρες με θετική έκφραση.Στις περιπτώσεις εμφράγματος του μυοκαρδίου, έντονη ανοσοέκφραση για Bcl-xL και Bcl-2 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις οξέος εμφράγματος, ενώ ήταν ήπια στις απομακρυσμένες περιοχές. Το Bcl-xL και το Bcl-2 δεν εκφράσθηκαν σε εμφραγματικές περιοχές στις περιπτώσεις οξέος εμφράγματος. Σε περιπτώσεις παλαιού εμφράγματος στα υγιή μυοκύτταρα παρατηρήθηκε ήπια έκφραση Bcl-xL και Bcl-2, ενώ στους μάρτυρες η έκφραση ήταν ήπια ή αρνητική. Χαμηλή έκφραση των Bax, bak, p53 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις οξέος εμφράγματος. Το Bax εκφράσθηκε στην εμφραγματική περιοχή. Αυξημένη έκφραση των Bax, bak και του p53 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις παλαιού εμφράγματος. Χαμηλή έκφραση των Bax, bak, p53 παρατηρήθηκε στους μάρτυρες.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Στη διατατική μυοκαρδιοπάθεια η καρδιακή ανεπάρκεια και η δυσλειτουργία των κοιλοτήτων της καρδιάς θέτουν τα μυοκαρδιακά κύτταρα απέναντι σε αυξημένο διαστολικό φορτίο και σε υψηλά επίπεδα τάσης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της διαδικασίας της απόπτωσης. Από την άλλη πλευρά η αυξημένη έκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών πιθανώς αντιπροσωπεύει το μηχανισμό άμυνας κατά της προοδευτικής απώλειας μυοκαρδιακών κυττάρων λόγω απόπτωσης και161στα πρώτα στάδια της καρδιακής ανεπάρκειας στοχεύει στην επιβράδυνση της εξέλιξης της νόσου. Στην οξεία ισχαιμία τίθενται σε δράση οι αντιαποπτωτικοί παράγοντες που αποτελούν και σε αυτήν την περίπτωση μηχανισμό άμυνας και επιβίωσης του μυοκαρδιακού κυττάρου. Σε αντίθεση, στη χρόνια ισχαιμία, υπερισχύουν οι προαποπτωτικοί παράγοντες, πιθανώς, γιατί εξαντλούνται τα ενεργειακά αποθέματα και οι μηχανισμοί άμυνας του κυττάρου. Επομένως, τόσο στην καρδιακή ανεπάρκεια, όσο και στην ισχαιμία του μυοκαρδίου, η υπεροχή των αντιαποπτωτικών ή προαποπτωτικών παραγόντων παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση του μυοκυττάρου ή στην επιτάχυνση της κυτταρικής βλάβης.