Μεταλλάξεις του γονιδίου της ενδογλίνης στην κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειεκτασία

Abstract

Hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) is an inherited autosomal dominant vascular dysplasia that occures at a frequency of 1 in 10000 and exhibits age-related penetrance with variable expression. The disorder is characterized by mucocutaneous telangiectases affecting the tongue, lips, fingers, ears and conjunctivae, in association with frequent epistaxis and gastrointestinal hemorrhages. Further clinical manifestations are pulmonary arteriovenous malformations, hepatic arteriovenous malformations and, in rare cases, splinal cord arteriovenous malformations, cerebral arteriovenous malformation, aneurysm and migraine headache.HHT is a genetically heterogeneous disorder. The first locus, HHT type 1, was mapped to chromosome 9q33-34, where Endoglin was defined as the affected gene. The second locus, HHT type 2, ALK-1 maps to chromosome 12q13. The third locus, HHT type 3, maps to chromosome 5 and the forth locus, HHT type 4, maps to chromosome 7.Endoglin is a homodimeric integral membrane glycoprotein who is expressed primarily in the vascular endothelial cell of capillaries, arterioles and venues.To date, 328 different mutations have been identified in the endoglin gene. These mutations include various deletions, splice site changes, small nucleotide insertions and deletions leading to frameshifts and premature stop codons. Mutations in the gene of Endoglin cause problems in the angiogenesis and in the reformation of conjunctive tissue.The aim of this study is to search for new or known mutations in Greek population, to determine if these mutations of endoglin are responsible for the Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia type 1.PATIENTS AND METHODSWe studied 4 families with HHT originating from Thessalia, Greece and 6 families from Crete, Greece. In addition we studied 11 isolated patients originating from Crete. Genomic DNA was isolated from peripheral blood lymphomonocytes or lymphoblastoid B-cell lines using the method of phenol-chloroform-isoamyl alcohol. Polymerase chain reaction (PCR, Real-Time PCR, RT-PCR) using flanking primers corresponding to intronic sequences for the amplification of exon sequences were designed in our laboratory based on the sequences of genes ENG recorded in GenBank (ENG - OMIM: 232295; 187300; GenBank: AH006911.1, BC014271.2). In most of the exons nested PCR was used, for further enhancement and discrimination of the product. Direct sequencing was used for analysis of nucleotide sequence of the DNA using the enzymatic method described by Sanger(Larc laboratories, Endimburg).RESULTSIn this group of patients, two novel, two previously reported mutations, and two polymorphisms were detected. The novel mutations included a large deletion of exon 2, 3 and και 4 (family 3,4,5,6 from Crete, patients 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 from Crete) and a duplication from the point 68 to 523 in exon 2 (patient 0.9 from Crete).The previously reported mutations included a deletion of a C in exon 1 (family 1 and 2 from Crete, patients 0.1, 0.2, 0.3 και 0.4 from Crete) and a deletion at the point 332-338 in exon 3 (patient 010 from Crete). The two polymorphisms included an insertion of a C at the point 35 of exon 1 (family 7 from Thessaly) and an insertion of a G at the point 315 in intron 11-12 (family 10 from Thessaly).CONCLUSIONIn our study we found mutations (new and already known), located in exons 1 to 11, which encode the extracellular portion of the protein. These mutations are leading to premature stop codons and abortive polypeptides. The mutant proteins are rarely detected and even when they are expressed, they do not appear at the cell membrane. Mutations that lead to a change in Frameshift are, possibly, reducing the levels of mRNA and leading to very unstable mutant proteins.

Προσδιορισμένη σχεδόν έναν αιώνα πριν η κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειεκτασία (ΗΗΤ) ή νόσος Rendu –Osler –Weber, θεωρούνταν για πολύ καιρό μία σπάνια περίπτωση που προκαλεί ελάχιστα δυσάρεστα συμπτώματα στα προσβεβλημένα άτομα. Οι αναγνωρισμένες εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειεκτασίας οφείλονται όλες σε ανωμαλίες της κατασκευής και της δομής των αγγείων. Οι πάσχοντες παρουσιάζουν μεγάλο εύρος συμπτωμάτων, ενώ οι κλινικές εκδηλώσεις συχνά διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των οικογενειών, αλλά και μεταξύ των μελών της ίδιας οικογένειας. Οι ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειεκτασίας περιλαμβάνουν αγγειακές διαταραχές (AVMs) στο ρινικό και στοματικό βλεννογόνο, στο δέρμα, στον εγκέφαλο, στον γαστρεντερικό βλεννογόνο, στο ήπαρ και στους πνεύμονες (PAVMs). Η HHT είναι γενετικά ετερογενής και διακρίνεται σε HHT-1 και HHT-2, HHT-3 και HHT-4, σύμφωνα με μεταλλάξεις στο γονίδιο της ενδογλίνης (ENG), στο γονίδιο ακτιβίνης Α υποδοχέα τύπου ΙΙ (ACVRL1) στο γονίδιο MADH4 και JPHT , αντίστοιχαΣκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αναζήτηση μεταλλάξεων του γονιδίου της ενδογλίνης σε έλληνες ασθενείς πάσχοντες από νόσο Rendu-Osler-Weber. Η χαρτογράφηση των μεταλλάξεων θα συμβάλει σημαντικά στην θεραπευτική παρέμβαση, πριν την εμφάνιση των συμπτωμάτων σε ασθενείς και μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την έκβαση της ασθένειας. Επιπλέον, σε οικογένειες στις οποίες υπάρχουν βαριές κλινικές εκδηλώσεις της νόσου, ο προγεννητικός έλεγχος δίνει στους γονείς την δυνατότητα να επιλέξουν διακοπή της κύησης ή όχι. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΥΛΙΚΟ: Χρησιμοποιήθηκαν ασθενείς της Πανεπιστημιακής Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Λάρισας, των οποίων έγινε μελέτη του οικογενειακού τους δένδρου. Οι 11 ασθενείς κατάγονται από τη Θεσσαλία και 28 κατάγονται από την Κρήτη. Επίσης μελετήθηκαν 10 μεμονομένα άτομα.ΜΕΘΟΔΟΙ: Τα δείγματα συλλέχθηκαν από τους ασθενείς σε μορφή αίματος. Ακολούθησε απομόνωση του DNA από το ολικό αίμα με τη μέθοδος της φαινόλης-χλωροφόρμιου-ισοαμυλικής αλκοόλης. Ακολούθησε πολλαπλασιασμός των εξονίων των υπεύθυνων γονιδίων με την μέθοδο της PCR. Το γονίδιο της ενδογλίνης αποτελείται από 14 εξόνια, από τα οποία τα 1 έως 13 είναι αυτά στα οποία έχουν εντοπιστεί οι έως τώρα γνωστές μεταλλάξεις. Για την διαδικασία της PCR χρησιμοποιήθηκαν περιβάλλοντες εκκινητές (flanking primers) για το κάθε εξόνιο, που έχει σχεδιαστεί στο εργαστήριό μας με βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων ENG που έχουν καταχωρηθεί στην GenBank (ENG – OMIM: 232295; 187300; GenBank: AH006911.1, BC014271.2). Στα περισσότερα από τα εξόνια χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της nested PCR, για περαιτέρω ενίσχυση του προϊόντος. Για τον προσδιορισμό της πρωτοταγούς νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA εφαρμόστηκε η ενζυμική μέθοδος κατά SangerΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΔιαπιστώθηκαν δύο νέες μεταλλάξεις, δύο γνωστές μεταλλάξεις και δύο πολυμορφισμοί. Οι νέες μεταλλάξεις περιλαμβάνουν 1) μία μεγάλη έλλειψη των εξονίων 2,3 και 4 (οικογένειες από την Κρήτη 4,5,6 και μεμονωμένοι ασθενείς 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 από την Κρήτη) και 2) μία επανάληψη στο εξόνιο 2 από την βάση 68 έως 523 (ασθενής 0.9 από την Κρήτη).Οι γνωστές μεταλλάξεις περιλαμβάνουν 1)μία απαλοιφή μίας C στην θέση 63 στο εξόνιο 1 (οικογένειες από την Κρήτη 1 και 2, ασθενείς 0.1, 0.2, 0.3 και 0.4 από την Κρήτη) και 2) απαλοιφή των βάσεων 332 έως 338 στο εξόνιο 3 (ασθενής 010 από την Κρήτη).Οι πιθανοί πολυμορφισμοί περιλαμβάνουν 1) μία ένθεση μιας C στην θέση 35 στο 1 (οικογένεια 7 από την Θεσσαλία) και 2) μία ένθεση μίας G στη θέση 315 στο ιντρόνιο μεταξύ των εξονίων 11 και 12(οικογένεια 10 από την Θεσσαλία). Οι διαφοροποιήσεις αυτές του DNA δεν σχετίζονται με την νόσο.ΣΥΖΗΤΗΣΗΣτην μελέτη μας βρέθηκαν μεταλλάξεις (νέες και ήδη γνωστές) που βρίσκονται στα εξόνια 1 έως 11, τα οποία κωδικοποιούν το εξωκυττάριο τμήμα της πρωτεΐνης. Οι μεταλλάξεις αυτές - όπως και το 80% των μεταλλάξεων του ENG γονιδίου - οδηγούν σε πρόωρα κωδικόνια λήξης και εκτρωτικά πολυπεπτίδια. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες σπάνια ανιχνεύονται ενώ ακόμη και, όταν εκφράζονται δεν φτάνουν στην κυτταρική μεμβράνη. Οι μεταλλάξεις, που οδηγούν σε αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης και κατακερματισμό πιθανώς καταλήγουν σε ελαττωμένα επίπεδα mRNA και πολύ ασταθείς μεταλλαγμένες πρωτεΐνες. Σε πρωτεϊνικό επίπεδο δεν μπορούν να εντοπιστούν οι πρωτεΐνες αλλά μόνο με DNA ανάλυση.