Ανίχνευση και επιδημιολογική διερεύνηση της παρουσίας Legionella στο υδάτινο περιβάλλον

Abstract

Legionella bacteria are widely distributed in aquatic environments, natural and man-made, and in soil. Control and prevention of legionellosis in hospital environments includes environmental monitoring, besides other measures.Collected data from the environmental monitoring, can be used as an important tool for risk assessment. They can provide a valid basis for corrective interventions, such as cleaning and disinfection and also for the preventive measures must be taken to maintain high water quality.In the present study, an environmental surveillance was made in seven health-care facilities in East-Macedonia and Thrace region, for the control and prevention of legionnaires' disease. Firstly, we investigated the prevalence of Legionella spp. and the correlation between their presence and physicochemical factors. We also detected other microorganisms like Pseudomonas spp.. At the final stage, we’ve investigated the molecular epidemiology of the strains in the region of Eastern Macedonia and Thrace and for individual health-care facility separately.A total of 663 water samples were collected during 2007-2011, including 629 samples from the water distribution system and 35 samples from the cooling system, of the health-care facilities. The choice for each sampling site and for the total number of samples for every health-care facility, were based on complexity of the buildings and the presence of high-risk patients. Sample sites were recorded and for each water sample, residual free chlorine and water temperature were measured.Of the 663 samples analyzed , Legionella spp. were detected in 120 (18%), of the 121 isolated strains from the 7 (100%) health-care facilities. Legionella pneumophila serogroup 2-15 were the predominant species, detected in 62%, followed by Legionella pneumophila serogroup 1 in 36% and Legionella spp. besides pneumophila, in 2% of the isolated strains.Molecular epidemiology of the potentially pathogenic species, Legionella pneumophila, was investigated using two molecular typing methods, RAPD-PCR analysis and sequence-based analysis of three target genes. Nucleotide sequences of the isolates were compared with other strains from the GenBank and the genetic correlations were reflected in genetic dendrograms.Molecular typing of the isolates revealed 6 different genotyping profiles, one of those was identical, in all three genes studied, with world-wide strain Paris.Each health-care facility had its own L. pneumophila genotyping profile, that existed over time or appeared occasionally. An exception constituted a specific genotype appearing in isolates of two hospitals.Molecular typing resulted in two main conclusions, regarding the population of L. pneumophila strains, a) a high degree of genetic heterogeneity exhibit in the region of AMTH between health-care facilities and that b) within each health-care facility, isolates have long-term genetic homogeneity.

Τα είδη του βακτηριδίου Legionella κατανέμονται ευρέως στα υδάτινα περιβάλλοντα, φυσικά και τεχνητά και στο έδαφος. Η πρόληψη και ο έλεγχος της λοίμωξης από Legionella στα νοσοκομειακά ιδρύματα περιλαμβάνει μεταξύ των άλλων μέτρων και τον περιβαλλοντικό έλεγχο με την διενέργεια δειγματοληψιών.Το πρόγραμμα των δειγματοληψιών μπορεί να είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να πραγματοποιείται μία γενικότερη αξιολόγηση του βαθμού επιμόλυνσης του δικτύου νερού στο νοσοκομείο, ή να πραγματοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας του βακτηριδίου κατά τη διάρκεια επιδημιολογικής διερεύνησης κλινικών περιστατικών.Στην παρούσα έρευνα πραγματοποιήθηκε περιβαλλοντική επιτήρηση 7 νοσηλευτικών ιδρυμάτων της περιφέρειας Ανατολικής Μακεδονίας και Θράκης στα πλαίσια της πρόληψης της νόσου των λεγεωναρίων. Διερευνήθηκε ο επιπολασμός των βακτηριδίων Legionella spp., ο συσχετισμός της παρουσίας τους με φυσικοχημικούς παράγοντες και άλλους μικροοργανισμούς και η μοριακή επιδημιολογία των στελεχών τόσο στην περιφέρεια της Ανατολικής Μακεδονίας και Θράκης συνολικά όσο και για κάθε νοσοκομείο ξεχωριστά. Συνολικά ελήφθησαν 663 δείγματα νερού κατά την περίοδο 2007-2011 , από τα οποία 629 ανήκαν στο δίκτυο ύδρευσης και τα 35 στο κλιματιστικό σύστημα των ιδρυμάτων. Η επιλογή των σημείων και ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε νοσηλευτικό ίδρυμα βασίστηκαν στην πολυπλοκότητα του κάθε δικτύου και στο είδος των ασθενών που φιλοξενούσαν οι αντίστοιχες κλινικές. Έγινε καταγραφή των σημείων δειγματοληψίας και μετρήθηκαν η θερμοκρασία του νερού και το υπολειπόμενο χλώριο σε κάθε δείγμα.Από τα 663 δείγματα, παρουσία βακτηριδίων Legionella spp. ανιχνεύθηκε στα 120 σε ποσοστό 18%, από τα οποία απομονώθηκαν 121 στελέχη και από τα 7 (100%) νοσηλευτικά ιδρύματα. Το επικρατέστερο είδος που απομονώθηκε ήταν το είδος Legionella pneumophila οροτύπου 2-15 σε ποσοστό 62%, ακολούθησε το είδος Legionella pneumophila οροτύπου 1 με 36% και τέλος τα είδη Legionella spp. εκτός από pneumophila με 2%. Στην συνέχεια διερευνήθηκε η μοριακή επιδημιολογία των απομονωθέντων στελεχών του δυνητικά παθογόνου είδους Legionella pneumophila μέσω δύο μοριακών μεθόδων τυποποίησης, της RAPD και της ανεύρεσης της αλληλουχίας των βάσεων τριών γονιδίων-στόχων. Οι αλληλουχίες των απομονωθέντων στελεχών συγκρίθηκαν τόσο μεταξύ τους, όσο και με άλλες της Διεθνούς Τράπεζας Γονιδιωμάτων (GenBank) και η γενετική συσχέτισή τους αντικατοπτρίστηκε σε γενετικά δενδρογράμματα. Η μοριακή τυποποίηση διαχώρισε τα απομονωθέντα στελέχη σε 6 διαφορετικά γενοτυπικά προφίλ, εκ τον οποίων το ένα εμφάνισε και στα τρία γονίδια 100% ομοιότητα με το στέλεχος Paris. Σε κάθε νοσηλευτικό ίδρυμα εμφανίζονταν στελέχη L. pneumophila ορισμένου γενοτύπου (συγκεκριμένου για κάθε νοσοκομείο), που επικρατούσαν διαχρονικά ή εμφανίζονταν περιστασιακά. Εξαίρεση αποτέλεσε ένας γενότυπος στον οποίο περιλαμβάνονταν στελέχη από δύο νοσοκομεία.Η μοριακή τυποποίηση κατέληξε σε δύο κύρια συμπεράσματα όσον αφορά τον πληθυσμό στελεχών L. pneumophila, ήτοι ότι α) στην περιφέρεια της ΑΜΘ τα στελέχη εμφανίζουν υψηλού βαθμού γενετική ετερογένεια και ότι β) εντός κάθε νοσηλευτικού ιδρύματος τα στελέχη εμφανίζουν μακρόχρονη γενετική ομοιογένεια.