Οι μηχανισμοί του τραυματισμού των ιστών και ο ρόλος της ενεργοποίησης του συμπληρώματος

Abstract

Ischemia and Reperfusion (I/R) injury is a major complicating feature of many clinical conditions. I/R is responsible for much of the severity of myocardial infarction, cerebral ischemic events, intestinal ischemia and many aspects of vascular surgery, trauma and transplantation. Intestinal I/R is a devastating syndrome. The mortality rate of most gastrointestinal ischemia-related deaths is 70-90%. Injury and inflammation cause by I/R are prominent in the intestine due to the sensitivity of the mucosal surfaces and is frequently followed by remote organs such as liver and lung.During ischemia cells undergo immediate injury by hypoxia and undergo specific changes in enzymatic activities, mitocondrial function and cytoscheletal structure. They also reveal neoantigens on the surface membrane which are recognized by pathogenic natural antibodies leading to the classical complement activation. During the reperfusion phase the injury is significantly amplified by the return of blood flow. During this phase several important inflammatory mediators (complement, cytokines, adhesion molecules, eicosanoids) are generated and amplify the ischemic injury. There is also recruitment and activation of neutrophils in the site of injury triggered by the inflammatory mediators. Neutrophils contribute to the development of injury by producing reactive oxygen species (H2O2) although are not sufficient to cause tissue injury without the presence of complement.Previous studies have shown that Complement activation is also involved in the effector phases of intestinal I/R tissue injury. Inhibition of the complement components (C3, C5, C4) can either inhibit or attenuate intestinal I/R-induced tissue injury. During activation of the complement pathway inflammatory mediators are generated (anaphylatoxins C5a, C3a, and MAC) and cause cellular activation and injury. The three peptides released during the steps of complement activation, C3a, C4a, and C5a, are known as anaphylatoxins. Those peptides mediate multiple reactions in the acute inflammatory response, including smooth muscle conteraction , changes in vascular permeability, histamine release from mast cells, neutrophil chemotaxis, platelet activation and aggregation, as well as up-regulation of adhesion molecules that can also play key roles in neutrophil recruitment.The mechanism of complement activation during intestinal I/R injury remains unclear. There is also little information regarding the specific complement activation pathways (classical, alternative or lectin) involved in tissue injury. Many findings have implicated the classical pathway in this process. Although the alternative pathway may also be implicated. It has been proposed that natural IgM antibodies bind to neoantigens revealed by cells during the ischemic phase and activate complement through the classical pathway. Complement activation leads to the generation of the complement components C3, C5 and MAC, adhesion molecule expression increases and inflammatory mediators (LTB4 and others) are released.The complement system consists of serum and cellular proteins, including positive and negative regulators, linked in three biochemical cascades, the classical, the alternative and the lectin pathway. The system is regulated at multiple levels. This regulation facilitates recognition of self from foreign tissue and, therefore, allows the control over the potent tissue-damaging capabilities of complement activation. It has been recognized that some of the endogenous complement regulatory proteins might serve as potential therapeutic agents in blocking inappropriate activation of complement in human disease. Soluble and membrane-bound variants of complement regulators have been produced and shown to be effective in blocking complement activation in vitro as well as in animal models of complement-mediated pathologies.Our group has previously shown that neoantigens are expressed in the injured endothelium during ischemia and that autoantibodies (anti-phospholipid, anti-cardiolipin) recognize and bind those neoantigens and reconstitute mesenteric I/R induced organ injury (intestine and lung) in Cr-2-/- and Rag-1-/- mice following mesenteric I/R. In the present study we show that anti-ribonucleoprotein antibodies mediate enhanced lung injury following mesenteric ischemia/reperfusion in Rag-/- mice and that the activation of complement plays a significant role in the injury. Anti-ribonucleoprotein antibodies were found to reconstitute mesenteric I/R induced injury in Rag-/- mice and to increase the inflammatory mediator production in the intestine. Also, were found to contribute in the enhancement of lung injury and in the production of inflammatory mediators in the lung. The observed injury in both organs increased with the rising of the anti-RNP titer and the anti-RNP antibodies are able to cause more injury in the lung compared to the intestine. We finally show that the organ injury mediated by the anti-ribonucleoprotein antibodies following mesenteric I/R is complement dependent by depleting complement activation using CVF.Furthermore, we show that the complement activation plays a significant role in the I/R induced injury of the remote organs in C57Bl/6 and B6.MRL/lpr mice subjected to hindlimb and mesenteric I/R using the membrane regulatory protein DAF (Decay Accelerating Factor). DAF was found to attenuate remote ischemia/reperfusion remote organ damage in C57Bl/6 mice subjected to hindlimb I/R, whereas it does not significantly affect the local injury (hindlimb or mesenteric). We show that the complement protein C3 is deposited in the hindlimb muscle following DAF treatment but there is no deposition of the membrane attack complex (MAC) on the surface of skeletal muscle. DAF significantly decreases injury in the remote organs (intestine and lung), with C3 deposition and without MAC deposition in the respective tissues. Similar results were found in the hindlimb I/R model as well as in the mesenteric I/R model in B6.MRL/lpr mice.The understanding of the mechanisms of tissue injury and the role of the regulators of complement activation will lead to the development of therapeutic interventions aiming to restore the function of the injured tissue and of remote tissues due to ischemia and reperfusion.

Ο τραυματισμός των ιστών έπειτα από Ισχαιμία και Υπεραιμία (Ι/Υ) είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα που συναντάται σε πολλές κλινικές καταστάσεις. Η Ισχαιμία/Υπεραιμία ευθύνεται για τη σοβαρότητα του εμφράγματος του μυοκαρδίου, εγκεφαλικών ισχαιμικών επεισοδίων, εντερικής ισχαιμίας και για πολλές όψεις της αγγειοχειρουργικής, του τραύματος και της μεταμόσχευσης. Η εντερική ισχαιμία είναι ένα ολέθριο σύνδρομο. Το ποσοστό των θανάτων που σχετίζονται με γαστρεντερολογική ισχαιμία είναι 70-90%. Ο τραυματισμός και η φλεγμονή που προκαλούνται απο ισχαιμία/υπεραιμία ειναι εμφανή στο έντερο λόγω της ευαισθησίας του βλεννογόνου και συχνά έπεται των απομακρυσμένων οργάνων οπως είναι το ήπαρ και ο πνεύμονας.Κατά τη διάρκεια της ισχαιμικής φάσης τα κύτταρα υφίστανται έμμεσο τραυματισμό εξαιτίας της υποξίας και υφίστανται ειδικές μεταβολές στην ενζυμική δράση, τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και τη δομή του κυτταροσκελετού. Επίσης εκθέτουν νεο-αντιγόνα στην επιφάνεια της κυτταρικής τους μεμβράνης τα οποία αναγνωρίζονται από παθογόνα φυσικά αντισώματα οδηγώντας στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Κατά τη διάρκεια της φάσης της υπεραιμίας, ο τραυματισμός ενισχύεται σημαντικά εξαιτίας της επιστροφής της ροής του αίματος. Σε αυτή τη φάση παράγονται σημαντικοί φλεγμονώδεις μεσολαβητές πρωτεΐνες του συμπληρώματος, κυτταροκίνες, μόρια προσκόλλησης, εικοσανοειδή) οι οποίοι ενισχύουν τον τραυματισμό μετά από ισχαιμία. Παρατηρείται επίσης συρροή και ενεργοποίηση ουδετεροφίλων στο σημείο του τραυματισμού η οποία προκαλείται από την παρουσία προ-φλεγμονοδών μεσολαβητών. Τα ουδετερόφιλα συμβάλλουν στον τραυματισμό παράγοντας ενεργά οξυγονούχες ενώσεις (Η2Ο2). Ωστόσο, η παρουσία των ουδετεροφίλων μόνο δεν επαρκεί για την κάκωση του ιστού και ο καίριος ρόλος της ενεργοποίησης του συμπληρώματος έχει αποδειχθεί. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος εμπλέκεται στον τραυματισμό του εντέρου μετά από Ι/Υ. Η αναστολή των συστατικών του συμπληρώματος (C3, C5, C4) μπορεί να αναστείλλει ή να εξασθενίσει τον τραυματισμό του εντέρου μετά από Ι/Υ. Κατά την ενεργοποίηση του συμπληρώματος παράγονται φλεγμονώδεις μεσολαβητές (αναφυλατοξίνες C5a και C3a και MAC) και προκαλούν ενεργοποίηση των κυττάρων και τραυματισμό. Κατά την ενεργοποίηση του συμπληρώματος οι τρεις αναφυλατοξίνες που απελευθερώνονται ευθύνονται για πολλαπλές αντιδράσεις της οξείας φλεγμονώδους αντίδρασης , στις οποίες περιλαμβάνονται η συστολή των λείων μυϊκών ινών, μεταβολλές στη διαπερατότητα των αγγείων, απελευθέρωση ισταμίνης από τα μαστοκύτταρα, χημειοτακτισμός των ουδετεροφίλων, ενεργοποίηση και συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων και επαγωγή των μορίων προσκόλλησης τα οποία παίζουν επίσης ρόλο στην επιστράτευση των ουδετεροφίλων.Ο μηχανισμός της ενεργοποίησης του συμπληρώματος κατά την μεσεντέριο Ι/Υ παραμένει αδιευκρίνιστος καθώς υπάρχουν λίγες πληροφορίες σχετικά με το ποιές οδοί εμπλέκονται στον τραυματισμό του ιστού. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει την εμπλοκή της κλασικής οδού αλλά πιθανώς να εμπλέκεται και η εναλλακτική οδός. Έχει υποτεθεί ότι τα φυσικά αντισώματα IgM προσδένονται στα νεοαντιγόνα που εκφράζονται στα κύτταρα κατά την ισχαιμική φάση και ενεργοποιούν το συμπλήρωμα μέσω της κλασικής οδού. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος οδηγεί στην παραγωγή των C3, C5 και MAC, στην αύξηση της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης και στην επελευθέρωση φλεγμονοδών (LTB4).Το σύστημα του συμπληρώματος αποτελείται από διαλυτές και κυτταρικές πρωτεΐνες περιλαμβανομένων των ρυθμιστικών μορίων, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους στις τρεις οδούς, την κλασική, την εναλλακτική και την οδό της λεκτίνης. Το σύστημα του συμπληρώματος ρυθμίζεται σε πολλά σημεία. Η ρύθμιση αυτή διευκολύνει το διαχωρισμό μεταξύ των ιστών του οργανισμού και των ξένων ιστών ελέγχοντας τις καταστροφικές δυνατότητες της ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Έχει παρατηρηθεί ότι ενδογενείς ρυθμιστικές πρωτεΐνες (διαλυτές ή μεμβρανικές) του συμπληρώματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν για θεραπευτικό σκοπό και συγκεκριμένα για την αναστολή της μη σωστής ενεργοποίησης του συμπληρώματος σε διάφορες ασθένειες. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ρυθμιστικά μόρια του συμπληρώματος είναι ικανά να εμποδίσουν την ενεργοποίηση του συμπληρώματος in vitro καθώς και σε πειραματόζωα με παθολογίες που δημιουργούνται εξαιτίας του συμπληρώματος. Η ερευνητική μας ομάδας έχει δείξει σε προηγούμενες μελέτες ότι κατά την διάρκεια της Ι/Υ εκφράζονται νεοαντιγόνα στην επιφάνεια του τραυματισμένου ενδοθηλίου, και ότι αυτοαντισώματα (anti-phospholipid, anti-cardiolipin) αναγνωρίζουν και προσδένονται στα νεοαντιγόνα αυτά αποκαθιστώντας τον τραυματισμό των οργάνων (εντέρου και πνεύμονα) σε ποντίκια Cr-2-/- και Rag-1-/- μετά από μεσεντέριο Ι/Υ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι τα αντισώματα έναντι της ριβονουκλεοπρωτεΐνης προκαλούν αύξηση του τραυματισμού του πνεύμονα μετά από μεσεντέριο Ι/Υ σε ποντίκια Rag-/- και ότι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον τραυματισμό αυτό. Τα αντισώματα έναντι της ριβονουκλεοπρωτεΐνης αποκαθιστούν τον τραυματισμό του εντέρου και αυξάνουν την παραγωγή των φλεγμονοδών μεσολαβητών. Επίσης συμβάλλουν στην αύξηση του τραυματισμού του πνεύμονα και στην παραγωγή φλεγμονοδών μεσολαβητών στον πνεύμονα. Ο τραυματισμός που παρατηρήθηκε και στα δύο όργανα αυξανεται με την αύξηση του τίτλου των αυτοαντισωμάτων και επίσης τα αυτοαντισώματα προκάλεσαν περισσότερο τραυματισμό στον πνεύμονα απότι στο έντερο. Τελευταία δείξαμε ότι ο τραυματισμός των οργάνων εξαιτίας των αυτοαντισωμάτων εξαρτάται από την ενεργοποίηση του συμπληρώματος χρησιμοποιώντας τον παράγοντα CVF. Επίσης, δείξαμε ότι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον τραυματισμό των απομακρυσμένων οργάνων μετά από Ι/Υ του οπισθίου άκρου και του εντέρου σε ποντίκια C57Bl/6 και B6.MRL/lpr χρησιμοποιώντας τη μεμβρανική ρυθμιστική πρωτεΐνη DAF (Decay Accelerating Factor). Δείξαμε ότι ο παράγοντας DAF εξασθενεί τον τραυματισμό των απομακρυσμένων οργάνων σε ποντίκια C57Bl/6 μετά από Ι/Υ του οπισθίου άκρου αλλά δεν επιδρά σημαντικά στον τραυματισμό του τοπικου οργάνου (σκελετικός μυς και έντερο). Η πρωτεΐνη C3 εναποτίθενται στο σκελετικό μυ ενώ δεν παρατηρείται εναπόθεση MAC μετά τη χορήγηση DAF. Ο DAF μειώνει σημαντικά τον τραυματισμό των απομακρυσμένων οργάνων (εντέρου και πνεύμονα), με εναπόθεση C3 και χωρίς εναπόθεση MAC στους ιστούς. Παρόμοια αποτελέσματα βρήκαμε χρησιμοποιώντας ποντίκια B6.MRL/lpr mice με Ι/Υ του οπισθίου άκρου και του εντέρου.Η κατανόηση των μηχανισμών του τραυματισμού των ιστών και του ρόλου της ενεργοποίησης του συμπληρώματος θα συμβάλλει στην ανάπτυξη θεραπευτικών μεθόδων με σκοπό την αποκατάσταση της λειτουργικότητας του ιστού που έχει υποστεί ισχαιμία και τραυματισμό καθώς και των απομακρυσμένων τραυματισμένων ιστών.