Διερεύνηση κυτταρικών, βιοχημικών και μοριακών βιομαρτύρων με τη χρήση του σαλιγκαριού Eobania vermiculata για την αποτίμηση της ρύπανσης χερσαίων οικοσυστημάτων

Abstract

A package of biomarkers was performed on land snails E. vermiculata collected from polluted areas in the field (the road Agiou Dimitriou in Thessaloniki city, the organophosphorus fertilizer industry in the district of Kavala and a lignite power station in the district of Kozani). An area in the distrinct of Pella was selected as a reference area. The package of biomarkers was also performed on snails treated in the laboratory with heavy metals and/or organophosphate insecticides chlopryrifos and parathion-methyl, as well as with PAHs. The biomarkers used were neutral red lysosomal retention assay of the haemocytes, acetylcholinesterase activity in the digestive gland and the haemolymph, and metallothionein content of the digestive gland. Moreover, the morphometric changes in the lysosomal system and the morphometric alterations of the neutral lipids were also investigated. In addition, the content of cadmium, lead and copper was evaluated in the digestive gland of the snails, with the use of atomic absorption spectrophotometry. The role of the signal transduction molecule cAMP, and the lysosomal membrane stability (LMS), as biomarkers of terrestrial environmental pollution was investigated. A new-ELISA assay for the measurement of protein carbonylation was used as a new biomarker of terrestrial pollution, as well as the ROS production and the DNA damage were measured. Finally, the seasonal influence on the values of LMS, NRR VDL, NDL, VDLP, NDLP, VDBSDs, NDBSDs, AChE, MTs and cAMP was investigated in the digestive gland or the haemolymph of snails E. vermiculata sampled on October (autumn) and May (spring).The results of the study revealed the intense response of the land snails to the application of all the previously mentioned biomarkers. This was demonstrated by the appreciable alterations in the biomarker values both in field- and laboratory- conditions, accompanied by significant correlations among the biomarkers. Therefore, this exploratory study suggests the utility of E. vermiculata as a sentinel organism for biomonitoring the biologic impact of terrestrial pollution, and supports the packages’s efficacy of the selected biomarkers. Τhe reliability of the previous biomarkers was supported on E. vermiculata, firstly by their ability to respond to heavy metals or organic pollutants and secondly by their significant linear correlation among them. Significantly increased levels of cAMP were shown in the digestive gland of snails, as well as decreased LMS values in all experimental groups compared to control animals, encouraging the use of cAMP as a new potential stress index in terrestrial pollution biomonitoring studies. The effectiveness of measuring ROS production and DNA damagewas indicated, as well as of using the present ELISA method, as sensitive tools of terrestrial pollution biomonitoring studies. The digestive cells and the haemocytes showed intense differentiations when compared at two different seasons.

Πραγματοποιήθηκε εφαρμογή ενός πακέτου βιομαρτύρων ρύπανσης σε σαλιγκάρια που συλλέχθηκαν από περιοχές με αυξημένη ρύπανση (η οδική αρτηρία στην πόλη της Θεσσαλονίκης, το εργοστάσιο φωσφορικών λιπασμάτων στο νομό Καβάλας και ένα εργοστάσιο παραγωγής ρεύματος της ΔΕΗ στο νομό Κοζάνης). Ως περιοχή ελέγχου επιλέχθηκε η περιοχή του κάμπου Εδέσσης. Οι βιομάρτυρες εφαρμόστηκαν και σε σαλιγκάρια που εκτέθηκαν στο εργαστήριο σε βαρέα μέταλλα (κάδμιο, μόλυβδος ή χαλκός) και/ή δύο οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα (chlorpyrifos ή parathion-methyl) ή σε μίγμα τριών πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs). Οι βιομάρτυρες που εφαρμόστηκαν ήταν η «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» (NRR) σε αιμοκύτταρα, η «δραστικότητα της ακετυλ-χολινεστεράσης» (AChE) στον πεπτικό αδένα και στην αιμόλεμφο και τα «επίπεδα των μεταλλοθειονινών» (MTs) στον πεπτικό αδένα. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι «μορφομετρικές αλλαγές των λυσοσωμάτων» (VDL, NDL) και οι «μορφομετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων» (VDLP, NDLP). Ακόμη, εκτιμήθηκαν τα επίπεδα των βαρέων μετάλλων, καδμίου, μολύβδου και χαλκού, στον πεπτικό αδένα των σαλιγκαριών, μέσω της ατομικής απορρόφησης. Διερευνήθηκε ο ρόλος του σηματοδοτικού μορίου cAMP και της «σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης σε κρυοτομές πεπτικού αδένα» (LMS) ως βιομαρτύρων της χερσαίας ρύπανσης με τη χρήση του σαλιγκαριού E. vermiculata. Πραγματοποιήθηκε εφαρμογή μιας νέας μεθόδου ELISA μέτρησης της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών, καθώς και μέτρηση της παραγωγής ROS και της βλάβης του DNA. Τέλος, μελετήθηκε η εποχική μεταβολή των βιομαρτύρων ρύπανσης, με σκοπό την επιλογή της καλύτερης περιόδου για τη διεξαγωγή πειραμάτων βιοπαρακολούθησης.Τα αποτελέσματα της μελέτης αποκάλυψαν μία έντονη απόκριση των χερσαίων σαλιγκαριών στην εφαρμογή των προαναφερθέντων βιομαρτύρων. Συνεπώς, η παρούσα μελέτη προτείνει τη χρήση του E. vermiculata ως οργανισμού βιο-ενδείκτη για τη βιοπαρακολούθηση των επιπτώσεων της χερσαίας ρύπανσης και ενισχύουν την προοπτική χρήσης των παραπάνω βιομαρτύρων σε μελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης από βαρέα μέταλλα και/ή οργανικούς ρύπους, με τη χρήση του χερσαίου σαλιγκαριού E. vermiculata. Αποκαλύφθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα του cAMP στον πεπτικό αδένα και σημαντικά μειωμένες τιμές της LMS σε όλες τις ομάδες σαλιγκαριών σε σχέση με τα σαλιγκάρια ελέγχου και ενισχύουν τη χρήση του cAMP ως νέου εργαλείου για μελέτες βιοπαρακολούθησης της χερσαίας ρύπανσης. Καταγράφηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της παραγωγής ROS, της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών και της βλάβης του DNA στα σαλιγκάρια που εκτέθηκαν σε ρύπους σε σχέση με τα σαλιγκάρια ελέγχου, γεγονός που ενισχύει τη χρήση των βιομαρτύρων «παραγωγή ROS» και «εκτίμηση της βλάβης του DNA» σε μελέτες χερσαίας βιοπαρακολούθησης και την εφαρμογή της καινούργιας μεθόδου ELISA ως βιομάρτυρα της χερσαίας ρύπανσης. Τέλος, έντονη λειτουργία του πεπτικού αδένα καταγράφηκε κατά την άνοιξη, με ενεργό λυσοσωμικό σύστημα, αυξημένη ποσότητα ουδέτερων λιπιδίων και αυτομεταλλογραφικών κόκκων και μικρότερη ποσότητα λιποφουσκίνης. Ακόμη, η υψηλότερες τιμές της δραστικότητας της AChE, των επιπέδων των ΜΤ και του cAMP κατά την άνοιξη αποτελούν επιπλέον ένδειξη της καλύτερης κατάστασης του πεπτικού αδένα των σαλιγκαριών την περίοδο αυτή.