Μελέτη των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στις ανοσολογικές αποκρίσεις του μυδιού Mytilus galloprovincialis: καθιέρωση νέων βιομαρτύρων περιβαλλοντικής ρύπανσης και μόλυνσης

Abstract

The main objective of the present doctorate thesis was to study the mechanisms and the molecules, which mediate environmentally-induced toxicity in M.galloprovincialis immune system and to suggest new biomarkers for biomonitoring of marine ecosystems. The results of the present study showed that treatment with infectious factors (E.coli TNFα), nanoparticles (nanoparticle of magnetide), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (mixture of anthracene, phenanthrene, napthalin), pesticides (lindane), heavy metals (cadmium) and hormones (17β-estradiol), representing the main categories of environmental stressors found in marine environment, activated the immune system of mussels, as observed through the statistically significant increase in phagocytic activity and specifically in the number of adherent hemocytes to extracellular matrix (ECM) proteins laminin-1, collagen-IV and oxidized collagen-IV. In addition, they caused statistically significant elevation in a2 integrin subunit levels, except for E. coli. Subsequently, cadmium and 17β-estradiol were selected, since they triggered the most significant response of the immune system, for further investigation of the mechanisms which mediate toxicity in hemocytes of mussels.The results showed that treatment of isolated hemocytes with either 5 μΜ of cadmium or 25 nM of 17β-estradiol resulted in oxidative stress, exemplified by statistically increase in intracellular ROS levels, statistically significant levels of DNA damage, of protein oxidation and of lipids peroxidation, as well as significant up-regulation of the genes encoding for the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione-S transferase (GST). Exposure of mussels M. galloprovincialis to either 0.3 μΜ of cadmium or 50 nM 17β-estradiol for 1, 3 and 7 days induced statistically significant increase in ROS levels, statistically significant increase in apoptotic levels of hemocytes and statistically significant decrease in mRNA expression levels of the three antioxidant enzymes CAT, SOD, GST.Additionally, the results of the present study suggest the involvement of Na+/H+ exchanger (NHE-1), all isoforms of protein kinase C (PKC), Ca2+-dependent PKC isoforms, phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3-Κ) and c-Jun N-terminal kinase (JNK), in signal transduction mechanisms related to environmentally-induced toxicity. NAD(P)H oxidase, nitric oxide (NO) synthase and reactive oxygen species (ROS) were also shown to be involved in these signaling pathways, suggesting the induction of respiratory burst in mussel hemocytes, as response to environmental stress. Increased intracellular levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) are protective against environmental stress. The increase in hemocyte adhesion to ECM proteins, in α2 integrin subunit levels, in ROS levels, in DNA damage, in protein oxidation, in lipid peroxidation, as well as the increased mRNA expression levels of the antioxidant enzymes CAT, SOD και GST in Mytilus galloprovincialis hemocytes are suggested as suitable biomarkers of environmental contamination, while their simultaneous use could be suggested as a multi-biomarker approach for an early-warning system in marine contamination.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν οι μηχανισμοί και τα μόρια επαγωγής τοξικότητας από περιβαλλοντικούς παράγοντες στο ανοσοποιητικό σύστημα του μυδιού M.galloprovincialis και να προταθούν νέοι βιομάρτυρες για τη βιοπαρακολούθηση των θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση μολυσματικών παραγόντων (E.coli TNF-α), νανοσωματιδίων (νανοσωματίδιο μαγνητίτη), πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) (μίγμα από ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλίνιο), φυτοφαρμάκων (λινδάνιο), βαρέων μετάλλων (κάδμιο) και ορμονών (17β-οιστραδιόλη), ενεργοποίησαν το ανοσοποιητικό σύστημα των μυδιών, όπως παρατηρήθηκε από τη στατιστικά σημαντική αύξηση της φαγοκυτταρικής ικανότητας και συγκεκριμένα του βαθμού προσκόλλησης των αιμοκυττάρων στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, λαμινίνη-1, κολλαγόνο IV και οξειδωμένο κολλαγόνο IV. Επίσης, προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης, με εξαίρεση το E. coli. Για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών επαγωγής τοξικότητας στα αιμοκύτταρα του μυδιού, επιλέχθηκαν οι ρύποι κάδμιο και 17β-οιστραδιόλη, που προκάλεσαν τη μεγαλύτερη απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση 5 μΜ καδμίου ή 25 nM 17β-οιστραδιόλης σε απομονωμένα αιμοκύτταρα προκάλεσε οξειδωτικό stress στα αιμοκύτταρα του μυδιού, το οποίο εκφράστηκε με στατιστικά σημαντική αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ROS, στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα βλάβης του γενετικού υλικού, οξείδωσης των πρωτεϊνών και υπεροξείδωσης των λιπιδίων καθώς και με ενεργοποίηση των αμυντικών μηχανισμών των αιμοκυττάρων, η οποία εκδηλώθηκε με στατιστικά σημαντική επαγωγή της μεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων που κωδικοποιούν τα αντιοξειδωτικά ένζυμα καταλάση (CAT), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) και τρανσφεράση –S της γλουταθειόνης (GST). Έκθεση μυδιών M. galloprovincialis σε 0,3 μΜ καδμίου ή σε 50 nM 17β-οιστραδιόλης για 1, 3 και 7 ημέρες προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα παραγωγής ROS, στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα απόπτωσης των αιμοκυττάρων και στατιστικά σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του mRNA των τριών αντιοξειδωτικών ενζύμων CAT, SOD, GST. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προτείνουν την συμμετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na+/H+ (NHE-1), όλων των ισομορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), των ισομορφών της PKC που εξαρτώνται από Ca2+, της κινάσης της φωσφατοδυλικής ινοσιτόλης (PI3-Κ) και της κινάσης του αμινοτελικού άκρου της c-jun (JNK), στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς, που σχετίζονται με την επαγωγή τοξικότητας από περιβαλλοντικούς ρύπους. Η συμμετοχή της NAD(P)H οξειδάσης, της συνθάσης του οξειδίου του αζώτου (NO) και των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς που επάγονται, προτείνουν την επαγωγή της «αναπνευστικής έκρηξης» στα αιμοκύτταρα του μυδιού, ως απόκριση στους περιβαλλοντικούς ρύπους. Αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα κυκλικής 3’-5’-μονοφωσφορικής αδενοσίνης (cAMP) φάνηκε να λειτουργούν προστατευτικά για το κύτταρο έναντι του περιβαλλοντικού στρες. Η αυξημένη προσκόλληση στις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, η αύξηση των επιπέδων της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης, τα αυξημένα επίπεδα των ROS, η βλάβη του DNA, η οξείδωση των πρωτεϊνών, η υπεροξείδωση των λιπιδίων και η απόπτωση, καθώς και οι τροποποιήσεις στα επίπεδα έκφρασης του mRNA των αντιοξειδωτικών ενζύμων CAT, SOD και GST στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis προτείνονται ως κατάλληλοι βιομάρτυρες περιβαλλοντικής ρύπανσης ή/και μόλυνσης, ενώ η ταυτόχρονη χρήση τους θα μπορούσε να αποτελέσει μία νέα πολύ-παραμετρική προσέγγιση για την έγκαιρη διάγνωση πρώιμων σταδίων της θαλάσσιας ρύπανσης ή/και μόλυνσης.