Ο ρόλος των μεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών στον καρκίνο των ωοθηκών

Abstract

In advanced ovarian cancer disease responses to chemotherapy are very low and are characterized with early relapse. Metastasis in the peritoneal cavity is one of the main caveats and there is no effective treatment to reduce metastasis and consequently limit disease evolution.In this study we report the effect of blocking CA125-mesothelin mediated cell adhesion in a mouse model system permitting in vivo imaging of peritoneal metastasis. We developed a luciferase-based system to monitor peritoneal metastasis progression. One day after IP implantation of luciferase-transfected human ovarian cancer cells (OVCAR5), mice were injected intraperitoneally (IP) with 5 mg/Kgr of anti-CA125 mAb (X52) and/or anti-mesothelin mAb (K1) or anti-mesothelin Bb (P4). Our preclinical study demonstrated that IP injections of acombination of X52 and K1 resulted in reduced tumor micrometastasis as assessed by in vivo imaging. Further analysis of the tumor microenvironment revealed a diminished presence of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs).Tumoral mucins, which are heavily glycosylated tumor antigens such as mesothelin are attached to tumor cells by mannose residue-containing glycolipids (GPI anchors). However, the binding of soluble mesothelin via mannose residues to mannose receptor has not been systematically studied. To address this issue, we analyzed the binding of tumor-released mesothelin to ascites-infiltrating macrophages from ovarian cancer patients. We also modeled functional interactions between macrophages and soluble mesothelin using an in vitro system of co-culture of healthy donor macrophages with human ovarian cancer cell lines in transwells. We found that soluble mesothelin binds to human macrophages and that the binding depended on the presence of GPI anchor and mannose receptor. We next challenged the system with antibodies directed against the mannose receptor domain 4 (CDR4-MR). We isolated three novel anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) using a yeast-display library of human scFv. Anti-CDR4-MR scFv #G11 could block mesothelin binding to macrophages and prevent tumor-induced phenotype polarization of CD206low macrophages towards TAMs. Our findings indicate that tumor-released mesothelin is linked to GPI anchor, engages macrophage mannose receptor, and contributes to macrophage polarization towards TAMs. We propose that compounds capable of blocking tumor antigen GPI anchor/CD206 interactions, such as our novel anti-CRD4-MR scFv, could prevent tumor-induced TAM polarization and have therapeutic potential against ovarian cancer, through controlling the polarization of tumor-infiltrating innate immune cells.Studying the tumor microenvironment is critical for designing appropriate therapeutic strategies against ovarian cancer. The cell surface protein B7-H4 (B7x/B7s) is expressed by various cancers and B7-H4+ tumor-associated macrophages (TAMs) or surrogate APCs negatively regulate T cell activation, possibly through interaction with a putative receptor, suggesting that targeting of surface B7-H4 with affinity reagents could mediate clinical effects. We studied B7-H4 cell surface expression in human samples from ovarian cancer ascites and solid tumors, as well as in human ovarian cancer cell lines after mouse passage and/or short term culture. B7-H4 was expressed on tumor-infiltrating macrophages and freshly harvested tumor cells derived from cancer patients and from a mouse xenograft model. However, B7-H4 cell surface expression was downregulated on tumor cells after short term in vitro culture. We next isolated anti-B7-H4 recombinant antibodies (scFvs) by differential screenings of a yeast-display scFv library derived from ovarian cancer patient's human B lymphocytes. Anti-B7-H4 scFvs reversed T-cell inhibition mediated by a B7-H4 recombinant protein, in response to anti-CD3 stimulation. Furthermore, anti-B7-H4 scFv 3#68 restored antigen-specific T cell suppression, mediated by B7-H4+ antigen-loaded APCs or B7-H4+ tumor cells (presentation in cis), and by TAMs (presentation in trans). Our data demonstrate that B7-H4 cell surface expression is inducible in vivo which enables cell surface targeting strategies against B7-H4, and further show that antibody blockade of B7-H4 can restore anti-tumor T cell responses in vitro.Ιn summary, we have elucidated the role of the abundant tumor released glycoproteins such as mesothelin and CA125 in the promotion of ovarian micrometastasis. Furthermore, we studied the consequences of mesothelin binding to its newly identified ligand, the macrophage mannose receptor. We found that blockade of such interactions could protect macrophages from tumor polarizationand preserve their pro-inflammatory phenotype. Moreover, we characterized the expression of B7-H4 in the ovarian cancer microenvironment and the B7-H4-mediated inhibition of tumor antigen-specific T cells. Finally, we identified novel anti-MR and anti-B7-H4 recombinant antibodies and evaluated their application for the development of new immunotherapeutic methods against ovarian cancer.

Καθώς η θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με τις συμβατικές χημειοθεραπείες δεν είναι αποτελεσματική, αναζητούνται προσεγγίσεις που στοχεύουν συγκεκριμένους καρκινικούς στόχους ή ειδικά σηματοδοτικά μονοπάτια.Ένας από τους στόχους αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη και CA125 στην εξέλιξη και μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών αλλά και η διερεύνηση εφαρμογών, που βασίζονται σε αντισώματα, με σκοπό τον περιορισμό των περιτοναϊκών μεταστάσεων. Έτσι, υποθέσαμε ότι η ταυτόχρονη στόχευση των δύο αυτών γλυκοπρωτεϊνών θα μπορούσε να περιορίσει πιο αποτελεσματικά τη μετάσταση. Για να ελέγξουμε την παραπάνω υπόθεση αναπτύξαμε ένα μοντέλο μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών στον ποντικό. Σύμφωνα με την in vivo απεικόνιση, η τοπική χορήγηση του συνδυασμού των δύο αντισωμάτων που στοχεύουν την μεσοθηλίνη και το CA125 περιόρισε τις μικρομεταστάσεις σε σύγκριση με τις ομάδες ποντικών στα οποία χορηγήθηκαν μεμονωμένα αντισώματα. Η ανάλυση των ανοσοποιητικών κυττάρων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος της περιτοναϊκής κοιλότητας έδειξε πως η συνδυασμένη θεραπεία περιόρισε α) τις μικρομεταστάσεις, β) το καρκινικό φορτίο και γ) τα δραστικά προερχόμενα από το μυελό ανοσοκατασταλτικά κύτταρα (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs). Η σημασία της παρατήρησής μας είναι προφανής, αφού ένα καρκινικό μικροπεριβάλλον με λιγότερα ανοσοκατασταλτικά στοιχεία ευνοεί την ανοσολογική απόρριψη του όγκου.Η μεσοθηλίνη, εκτός από μια γλυκοπρωτεΐνη προσδεδεμένη στην κυτταρική επιφάνεια μέσω «άγκυρας» γλυκοσυλο-φωσφατιδυλο-ϊνοσιτόλης (GPI), υπάρχει και σε εκκρινόμενη μορφή και συνιστά έναν καρκινικό δείκτη στον ορό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Διατυπώσαμε την υπόθεση ότι τα καρκινικά αντιγόνα με άγκυρα GPI όπως η μεσοθηλίνη, μπορούν να δεσμεύονται στον υποδοχέα της μαννόζης (MR) που εκφράζεται από τα μακροφάγα τα οποία διηθούν τους καρκίνους, μέσω των τελικών καταλοίπων μαννόζης. Επίσης η πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης στον MR, θα μπορούσε να συνεισφέρει στην ενεργοποίηση των μακροφάγων προς έναν εναλλακτικό, σχετιζόμενο με τον καρκίνο φαινότυπο (TAM). Για να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση ελέγξαμε την ύπαρξη προσδεδεμένης μεσοθηλίνης στην επιφάνεια μακροφάγων από ασκίτες ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Με κυτταρομετρία ροής βρήκαμε ότι τα μακροφάγα τα οποία εξέφραζαν τον υποδοχέα της μαννόζης είχαν στην επιφάνειά τους προσδεδεμένη μεσοθηλίνη. Σε in vitro πειράματα που περιελάμβαναν καλλιέργεια ώριμων μακροφάγων και καρκινικών σειρών ωοθήκης σε συστήματα transwell, επιβεβαιώσαμε την πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης σε μακροφάγα που στο τεχνητό καρκινικό περιβάλλον υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της μαννόζης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε πως η εκκρινόμενη μεσοθηλίνη που δεν διαθέτει άγκυρα GPI δεν προσδένεται σε μακροφάγα. Για να αποδείξουμε πως η πρόσδεση οφειλόταν στον υποδοχέα της μαννόζης απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα κατά της υπομονάδας που αναγνωρίζει με ειδικότητα κατάλοιπα μαννόζης (anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) μετά από σάρρωση βιβλιοθήκης ζύμης που εκφράζει στην επιφάνειά της ανασυνδυασμένα αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά παρεμπόδισαν την πρόσδεση της μεσοθηλίνης. Επιπλέον, ο κλώνος #G11, απέτρεψε την πόλωση των μακροφάγων σε φαινότυπο TAM. Αυτό αποδεικνύει πως παράγοντες ικανοί να ρυθμίζουν την πόλωση των μακροφάγων στο καρκινικό μικροπεριβάλλον είναι δυνατόν να πυροδοτήσουν την απόρριψη του όγκου από τοανοσοποιητικό σύστημα.Για να διευρύνουμε τη στόχευση των σχετιζόμενων με τον καρκίνο μακροφάγων (ΤΑΜ), μελετήσαμε επίσης την γλυκοπρωτείνη Β7-Η4 που 1) αντιπροσωπεύει έναν από τους σημαντικούς καταστολείς των Τ λεμφοκυττάρων, 2) υπερεκφράζεταιι στα ΤΑΜ και 3) συσχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα και κακή πρόγνωση για την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Μετά από ανάλυση πρωτογενών καρκινικών κυττάρων από ασκίτες ή συμπαγείς όγκους ή από ποντικούς στους οποίους είχαν δημιουργηθεί όγκοι ωοθήκης, εντοπίσαμε αυξημένη έκφραση του Β7-Η4 στην κυτταρική επιφάνεια. Επίσης, βρήκαμε πως τα διηθούμενα στον όγκο μακροφάγα παρουσίαζαν αυξημένη επιφανειακή έκφραση του Β7-Η4. Για τη στόχευση του Β7-Η4 των καρκινικών κυττάρων και των ανοσοκατασταλτικών ΤΑΜ, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα. Επιλεγμένοι κλώνοι αντισωμάτων κατά του Β7-Η4 μελετήθηκαν λεπτομερώς για την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την ανοσοκατασταλτική δράση του Β7-Η4. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κλώνος 3#54 μπορούσε να αντιστρέψει την καταστολή της ενεργότητας Τ λεμφοκυττάρων μετά από ομοιοπολική ενεργοποίηση μέσω του CD3 μορίου παρουσία της ανασυνδυασμένης Β7-Η4 πρωτεΐνης. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το B7-H4 που εκφράζεται in cis από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα ή in trans από ΤΑΜs μειώνει την ενεργοποίηση Τ κυττάρων με ειδικότητα για καρκινικά αντίγονα κατόπιν αναγνώρισης των κυττάρων-στόχων τους. Τo ανασυνδυασμένο αντίσωμα κατά του B7-H4 3#54 από την άλλη, εξουδετερώνει την αρνητική επίδραση του Β7-Η4 προάγοντας την ανοσολογική απόκριση των Τ λεμφοκυττάρων κατά των καρκινικών στόχων ή κυττάρων που παρουσιάζουν τον αντιγονικό επίτοπο. Ανακεφαλαιώνοντας, στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τον ρόλο της υπερέκφρασης των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη, CA125, MR και B7-H4. Οι συγκεκριμένες αποτελούν σημαντικούς διαγνωστικούς και προγνωστικούς δείκτες στον καρκίνο των ωοθηκών. Μελετήσαμε την πρόσδεση αυτών των αντιγόνων σε μακροφάγα ή σε Τ λεμφοκύτταρα και αποκαλύψαμε σημαντικές συνέπειες των αλληλεπιδράσεων αυτών για την ανοσολογική απόκριση έναντι καρκινικών κυττάρων. Τέλος, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα έναντι των παραπάνω γλυκοπρωτεϊνών και διερευνήσαμε την εφαρμογή τους σε πειραματικές μελέτες για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων στον καρκίνο των ωοθηκών.