Συσχέτιση του γενοτύπου της πρωτεΐνης prion και συσχέτισή του με την τρομώδη νόσο (scrapie) σε πρόβατα και γίδια φυλών που εκτρέφονται στην Ελλάδα

Abstract

The aim of this study was the determination of PRNP polymorphisms associated with sensitivity and/or resistance of sheep and goats to Scrapie and subsequently the quantitative determination of their frequencies in pure Greek breed sheep and goats populations. The study is separated in three sessions. In the 1st session, the correlation between PRNP genotype and classical Scrapie was studied in three mixbred sheep flocks. In the 2nd one, the correlation between PRNP genotype and classical Scrapie was studied in one mixbred goat herd. In the 3rd session the correlation between PRNP genotype and atypical Scrapie was studied in the animals of the last herd. Finally, in the 4th session, the frequencies of resistant and sensitive to Scrapie genotypes were determined in sheep and goats of Greek pure breed, derived from Scrapie free herds. Sixty five out of the 271 examined sheep revealed in WB a molecular profile similar to the one of classical scrapie. Ovine alleles ARR and VRQ were found to be associated with resistance and sensitivity to classical scrapie infection. Classical scrapie was also diagnosed in the central nervous system and/or the lymphatic tissue in 27 out of the 98 goats. Lysine (K) at codon 222 of the caprine PRNP was found to confer a significant degree of protection to natural scrapie infection (P=0.0111). Glutamine (Q) at codon 211 was observed in eight animals, all of them scrapie-negative, which indicates a protective role of this polymorphism. A significant positive association (P=0.0457) between scrapie affected goats and the QRQS240 allele is presented for first time. However, in 10 additional clinically healthy goats which were negative for classical scrapie in Western Blot (WB), a distinct PrPres fragment of a molecular mass of ~12 kDa was identified. Five out of the 10 animals displayed genotypes with polymorphisms K222 and/or Q211 which have been connected with resistance to classical scrapie. Genotyping of the Greek purebred sheep population revealed higher frequency of the resistant allele ARR in Serres breed compared to Frisarta and Boutsko. In goats of Skopelos and Indigenous Hellenic breeds, the resistant to classical scrapie allele HRQRΚ222S was presented in low frequencies (3,64% and 4,6%, respectively). Regarding the pure breeds, we ascertained that the resistant allele ARR presented in all of the examined sheep breeds, though in low frequency thus making necessary the implementation of a genetic program against classical Scrapie in these three Greek breeds. The Serres breed seems to be closer to this goal in comparison to the Frisarta and Boutsko breeds. Similar strategy should be established in goats of Skopelos and Indigenous Hellenic breed since their resistant allele frequencies were found to be very low. Resistant alleles that include K222 and Q211 can provide the basis for the development of a feasible breeding program for scrapie eradication in goats. The performance of the different methods applied for the diagnosis of Scrapie in goats revealed novel aspects of the nature and diversity of the molecular PrPres phenotypes in goats and thus is needed to reconsider prion detection methodology.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάδειξη πολυμορφισμών του γονιδίου της πρωτεΐνης prion (PRNP) που σχετίζονται με την ευαισθησία και/ή την ανθεκτικότητα προβάτων και γιδιών στη Τρομώδη νόσο (ΤΝ) και στη συνέχεια ο ποσοτικός προσδιορισμός της συχνότητας εμφάνισης καθενός από τους πολυμορφισμούς αυτούς σε πληθυσμούς προβάτων και γιδιών καθαρόαιμων ελληνικών φυλών. Η διατριβή χωρίζεται σε τέσσερις ενότητες. Στην 1η ενότητα μελετήθηκε η σχέση γενοτύπου και κλασικής ΤΝ σε τρία μολυσμένα ποίμνια προβάτων. Στη 2η ενότητα μελετήθηκε η σχέση γενοτύπου και κλασικής ΤΝ σε γίδια μίας μολυσμένης εκτροφής. Στην 3η ενότητα μελετήθηκε η σχέση γενοτύπου και «άτυπης ΤΝ» στα γίδια της προαναφερθείσας εκτροφής. Τέλος, στην 4η ενότητα προσδιορίστηκε η συχνότητα εμφάνισης των ανθεκτικών και ευαίσθητων στην ΤΝ γενοτύπων, σε πρόβατα και γίδια καθαρόαιμων ελληνικών φυλών. Εξήντα πέντε από τα 271 πρόβατα ανέδειξαν κατά την εξέταση με Western Blot (WB), μοριακό προφίλ παρόμοιο με εκείνο της κλασικής ΤΝ. Τα αλληλόμορφα των προβάτων ARR και VRQ βρέθηκαν να σχετίζονται με ανθεκτικότητα και ευαισθησία στη μόλυνση από κλασική ΤΝ, αντίστοιχα. Κλασική ΤΝ διαγνώσθηκε επίσης στο ΚΝΣ και/ή στο λεμφικό ιστό σε 27 από τα 98 γίδια. Η Λυσίνη (Κ) στο κωδικόνιο 222 του PRNP των γιδιών βρέθηκε να προσφέρει σημαντικού βαθμού προστασία απέναντι στη μόλυνση με κλασική ΤΝ (P=0.0111). Η Γλουταμίνη (Q) στο κωδικόνιο 211 που εμφανίστηκε σε 8 γίδια, αρνητικά στην κλασική ΤΝ, αποτελεί ένδειξη για προστατευτικό ρόλο του πολυμορφισμού αυτού. Για πρώτη φορά παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του αλληλομόρφου QRQS240 και των προσβεβλημένων με κλασική ΤΝ γιδιών. Ωστόσο, σε 10 κλινικώς υγιή ζώα, στα οποία δε φάνηκε κανένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της κλασικής ΤΝ, επιβεβαιώθηκε η παρουσία ενός νέου PrPres πεπτιδικού τεμαχίου, μοριακού βάρους ~12kDa. Πέντε από τα 10 αυτά ζώα έφεραν ανθεκτικούς στην κλασική ΤΝ πολυμορφισμούς. Η γενοτύπηση αρκετά μεγάλου αριθμού προβάτων καθαρόαιμων ελληνικών φυλών έδειξε υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης του ανθεκτικού αλληλομόρφου ARR στη φυλή Σερρών συγκριτικά με τις αντίστοιχες που παρατηρήθηκαν στις φυλές Φρισάρτα και Μπούτσκο. Στα γίδια των φυλών Σκοπέλου και Εγχώριας Ελληνικής το ανθεκτικό στην κλασική ΤΝ αλληλόμορφο HRQRΚ222S εμφανίστηκε σε χαμηλά ποσοστά (3,64% και 4,6%, αντίστοιχα). Όσον αφορά στις καθαρόαιμες φυλές, η παρουσία του ανθεκτικού αλληλομόρφου ARR και στις τρεις φυλές προβάτων που εξετάστηκαν, αλλά σε χαμηλά ποσοστά, επιβάλλουν την εφαρμογή προγράμματος γενετικής επιλογής σε αυτές, με στόχο την εξάλειψη της ΤΝ. Η φυλή Σερρών φαίνεται να βρίσκεται πλησιέστερα, συγκριτικά με τις Φρισάρτα και Μπούτσκο, στην επίτευξη του στόχου αυτού. Παρόμοια στρατηγική πρέπει να εφαρμοσθεί και στα γίδια των φυλών Σκοπέλου και Εγχώριας Ελληνικής, αφού η συχνότητα των ανθεκτικών αλληλομόρφων που περιλαμβάνουν τους πολυμορφισμούς K222 και Q211 ήταν πολύ χαμηλή. Συνεπώς, ανθεκτικά αλληλόμορφα που περιλαμβάνουν τους πολυμορφισμούς K222 και Q211 μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη ενός εφικτού προγράμματος εξάλειψης της ΤΝ στα γίδια. Η εφαρμογή των μεθόδων εξέτασης που χρησιμοποιήσαμε για τη διάγνωση της ΤΝ στα γίδια ανέδειξε πρωτότυπες πτυχές για τη φύση και την ποικιλότητα των μοριακών χαρακτηριστικών της PrPres των γιδιών, οι οποίες προβάλλουν την ανάγκη για αναθεώρηση της υπάρχουσας μεθοδολογίας και αποτελούν αφορμή για περεταίρω έρευνα.