Τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας κυττάρων σε κολλαγόνο τύπου Ι (3-Dinensional collagen system) και ανάλυση της αντίδρασης των κυττάρων του περριριζίου στα οστεοενσωματούμενα εμφυτεύματα στην οδοντιατρική επιστήμη

Abstract

A vast plethora of research studies especially in vitro have tried to clarify the effect of surface characteristics of titanium implants in the morphological and biochemical characteristics of cellular components involved in the process of osseointegration. It has also been evident that the morphology of several intracellular componenets is influenced partly and driven by the form of treatment that the external surface of the titanium implant has been undergone. The main purpose of this in vitro investigation was the study of the differentiation of periodontal ligament cells in single and three-dimensional collagen culture systems. Additionally, is was evaluated the effect of mechanical processing (SMOOTH surface), chemical treatment with acid (OSSEOTITE surface), treatment with hydroxyapatite coating (HA surface), simultaneous treatment with sandblasting and acid (SLA surface) and the addition of nitrogen gas (N₂) and isotonic sodium chloride (NaCl) in sandblasted and chemically treated titanium surfaces (SLACTIVE surface) to the initial adhesion, proliferation and osteoblastic differentiation of human periodontal ligament cells. Materials for this study were human periodontal ligament cells from 3 different cell lines derived from 3 maxillary premolars of healthy young adults free from dental caries and periodontal disease, which were extracted for orthodontic reasons. Titanium implants used in this study had their outer surface been processed with mechanical treatmanet (sandblasting) and chemical treatment (acid), had been coated with hydroxyapatite and had been treated with isotonic sodium chloride solution (NaCl) and nitrogen gas (N₂). Cell numbers was measured using the trypan blue dye exclusion assay. The evaluation of the activity of alkaline phosphatase was determined using a photometric method and the evaluation of osteocalcin expression was carried out using a chemiluminescent immunoassay. While the expression of transcription factor cbfa-1 was performed usin the method of relative-quantitative polymerase chain reaction. All cultured cells were found to express vimentin (a phenotypic indicator that reveals mesenchymal cell origin) in single layer culture system and maintenance of the expression in three-dimensional culture system of collagen fibers. On the other hand, expression of the α-smooth muscle actin (phenotypic indicator that shows fibroblastic origin of cells) was only found in the monolayer culture system and it was prominent a lack of conservation of expression in three-dimensional culture system of collagen fibers. Regarding the initial attachment of cells, no statistically significant difference was foun between the examined surfaces. Instead, at the 3rd, the 12th and 30th days of incubation, the surface SLActive was superior in cell proliferation in a statistically significant degree in respect of SLA, HA, OSS, SMOOTH surfaces. The expression of alkaline phosphatase as a marker of osteoblastic differentiation was found to be greater in a statistically significant extent on days 1, 7 and 30 of the experiment with the SLActive surface to predominate. Unlike no difference was found on days 3 and 12. The expression of osteocalcin was almost non-detectable and statistically non-editable. The relative mRNA expression of factor cbfa-1 in the presence of the SLACTIVE implant surface increased significantly (>50%) compared with the corresponding relative mRNA expression of factor cbfa-1 in the presence of the SLA implant. In conclusion, it could be said that the results of this study demonstrate the superiority of SLActive surface regarding cell compatibility and the ability to induce the osteoblastic phenotype in the periodontal ligament cells.

Αντικείμενο πληθώρας ερευνητικών μελετών κυρίως σε επίπεδο in vitro έχουν επιχειρήσει να διελευκάνουν την ακριβή επίδραση των επιφανειακών χαρακτηριστικών των οστεοενσωματούμενων εμφυτευμάτων τιτανίου στα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των κυτταρικών στοιχείων που καθορίζουν τη βιολογική διαδικασία της οστεοενσωμάτωσης. Κύριος σκοπός της παρούσας, in vitro, έρευνας ήταν η μελέτη της διαφοροποίησης των κυττάρων του περιρριζίου σε μονοδιάστατα και σε τρισδιάστατα συστήματα καλλιέργειας κολλαγόνου και η αξιολόγηση της επίδρασης της μηχανικής επεξεργασίας (επιφάνεια SMOOTH), της χημικής επεξεργασίας με οξύ (επιφάνεια OSSEOTITE), της επεξεργασίας με επίστρωση υδροξυαπατίτη (επιφάνεια HA), της ταυτόχρονης επεξεργασίας με αμμοβολή και οξύ (επιφάνεια SLA) και της προσθήκης αερίου αζώτου (N₂) και ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (NaCl) σε αμμοβολημένες και χημικά επεξεργασμένες επιφάνειες τιτανίου(επιφάνεια SLACTIVE), στην αρχική προσκόλληση, στον πολλαπλασιασμό και στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση κυττάρων του ανθρώπινου περριριζίου. Υλικά για την παρούσα μελέτη αποτέλεσαν: ανθρώπινα περιρριζικά κύτταρα από 3 διαφορετικές κυτταρικές σειρές που προήλθαν από 3 προγομφίους άνω γνάθου, υγιών και νεαρών ατόμων, ελεύθερων τερηδόνας και περιοδοντικής νόσου, οι οποίοι εξήχθησαν για ορθοδοντικούς λόγους, εμφυτεύματα Τιτανίου στα οποία η εξωτερική επιφάνεια τους έχει υποστεί μηχανική (αμμοβολή), χημική επεξεργασία (οξύ), επίστρωση με υδροξυαπατίτη και προσθήκη ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (NaCl)/αερίου (N₂). Η μελέτη της διαφοροποίησης των κυττάρων στο μονοδιάστατο και τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, Η µέτρηση των κυττάρων έγινε µε τη µέθοδο του αποκλεισµού της χρωστικής κυανούν του τροπανίου (trypan blue dye exclusion assay) από τα ζωντανά κύτταρα. Η αξιολόγηση της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης έγινε με φωτομετρική μέθοδο ενώ η αξιολόγηση της έκφρασης οστεοκαλσίνης πραγματοποιήθηκε μέσω μιας ανοσολογικής δοκιμής χημειοφωταύγειας. Ενώ η έκφραση του παράγοντα μεταγραφής cbfa-1 έλαβε χώρα με την μέθοδο της σχετικής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης.Κατά την καλλιέργεια των κυττάρων του περιρριζίου παρατηρείται έκφραση βιμεντίνης (φαινοτυπικός δείκτης που αποδεικνύει μεσεγχυματική προέλευση των κυττάρων) στο μονόστιβο σύστημα καλλιέργειας και διατήρηση της έκφρασης στο τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας από ίνες κολλαγόνου. Ενώ παρατηρείται έκφραση α-Ακτίνης του Λείου Μυός (φαινοτυπικός δείκτης που αποδεικνύει ινοβλαστικό χαρακτήρα των κυττάρων) στο μονόστιβο σύστημα καλλιέργειας και απουσία διατήρησης της έκφρασης στο τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας από ίνες κολλαγόνου. Όσον αφορά την αρχική προσκόλληση των κυττάρων δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιφανειών. Αντίθετα, την 3η, την 12η και την 30η ημέρα της επώασης, η επιφάνεια SLActive υπερτερούσε σε βαθμό στατιστικά σημαντικό έναντι της SLA, HA, OSS, SMOOTH στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η έκφραση της Αλκαλικής Φωσφατάσης ως δείκτη οστεοβλαστικής διαφοροποίησης βρέθηκε να είναι μεγαλύτερη σε βαθμό στατιστικά σημαντικό για τις ημέρες 1, 7 και 30 του πειράματος με την επιφάνεια SLActive να υπερτερεί, αντίθετα δεν υπήρξε διαφορά για τις ημέρες 3 και 12. Η έκφραση Οστεοκαλσίνης ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη και μη στατιστικά επεξεργάσιμη. Η σχετική έκφραση του mRNA του παράγοντα cbfa-1 παρουσία του εμφυτεύματος SLACTIVE αυξήθηκε σημαντικά (>50%) σε σύγκριση με την αντίστοιχη σχετική έκφραση του mRNA του παράγοντα cbfa-1 παρουσία του εμφυτεύματος SLA. Συμπερασματικά, θα μπορούσε να λεχθεί ότι τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής καθιστούν σαφή την υπεροχή της SLActive επιφάνειας όσον αφορά την κυτταρική συμβατότητα της και την ικανότητα να επάγει τον οστεοβλαστικό φαινότυπο των κύτταρών του περιρριζίου.