Κλινική αξιολόγηση και μελέτη ισομορφών της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης και του νέου αποπτωτικού γονιδίου BCL2L12 στο γαστρικό καρκίνο

Abstract

In the present study, the expression analysis of both DDC and BCL2L12 mRNA isoforms has been accomplished, in gastric cancer. Stomach tissue specimens were obtained and the expression levels of DDC and BCL2L12 splice variants were assessed by a regular PCR methodology on a thermal cycler. A highly-sensitive, multiplex Real-Time PCR using TaqMan probes was also developed on a thermal cycler in order to achieve the quantification of the BCL2L12-A mRNA levels. Total protein was extracted from homogenized stomach tissues and the presence of the alt-DDC protein in stomach specimens was investigated by immunoblotting. The specificity of anti alt-DDC antibodies was evaluated using mass spectrometry. The chemotherapy response of the gastric cancer cell line AGS was analyzed with BCL2L12 and DDC gene expression being compared to the mRNA levels of other apoptosis-related genes. TaqMan Real-Time PCR analysis depicted an overexpression of BCL2L12-A in cancerous samples. Moreover, a statistically significant relationship was found between the expression of BCL2L12-A in stomach tissues and both the TNM stage of the disease and the grade of the tumor. Survival analysis has also depicted that BCL2L12-A negative patients have survived for a longer period than the BCL2L12-A positive ones. Regular PCR analysis for neuronal and non-neuronal DDC variants showed minor changes between healthy and cancer tissues. The expression of alt-DDC was detected in few stomach tissues and analysis depicted a non statistically significant up-regulation in cancer specimens. Western blotting analysis revealed the presence of the alt-DDC protein in gastric samples, though in varying levels. The chemosensitivity assay revealed that apoptotic genes and DDC appeared to behave in a diverse manner in the AGS cell line. The expression profiles of DDC and BCL2L12 in stomach cancer cells suggest their potential application in the discrimination and monitoring of the appropriate curative treatment, in the vein of a more drastic disease treatment.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη μελέτη και την κλινική αξιολόγηση ισομορφών mRNA των γονιδίων DDC και BCL2L12 στον καρκίνο του στομάχου. Συλλέχθηκαν καρκινικά και φυσιολογικά δείγματα στομάχου και πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης διαφόρων ισομορφών mRNA των γονιδίων DDC και BCL2L12, με τη μέθοδο της συμβατικής PCR. Αναπτύχθηκε μεθοδολογία πολλαπλής ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (multiplex qReal-Time PCR) με χρήση ανιχνευτών TaqMan, για τον σχετικό ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του εναλλακτικού μεταγράφου BCL2L12-Α στα δείγματα ιστού. Σε έναν αριθμό δειγμάτων στομάχου πραγματοποιήθηκε στύπωση Western και ανοσοεντοπισμός της πρωτεΐνης alt-DDC. Η ειδικότητα του ειδικού αντισώματος διερευνήθηκε με φασματομετρία μάζας. Η απόκριση της καρκινικής κυτταρικής σειράς του στομάχου, AGS, σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, αναλύθηκε με τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA των γονιδίων DDC και BCL2L12 αλλά και άλλων γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν την αυξημένη έκφραση του μετάγραφου BCL2L12-A στους καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς. Ακόμη, παρατηρήθηκε θετική σχέση με το σύστημα TNM και τον βαθμό διαφοροποίησης, ενώ κατά την ανάλυση επιβίωσης οι ασθενείς με αρνητικούς για την έκφραση του BCL2L12-Α καρκίνους επιβίωσαν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από εκείνους που παρουσιάζουν θετική έκφραση του BCL2L12-Α. Tα μετάγραφα νευρικού και μη νευρικού τύπου του γονιδίου DDC παρουσίασαν μικρές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων ιστού. Το μετάγραφο alt-DDC δε βρέθηκε να εκφράζεται στην πλειονότητα των ιστών, ενώ παρουσίασε αυξημένη έκφραση στα καρκινικά δείγματα. Τα πειράματα ανοσοστύπωσης κατέδειξαν πως τα επίπεδα της πρωτεΐνης alt-DDC στο συγκεκριμένο τύπο ιστού ποικίλλουν και συσχετίζονται με τα αντίστοιχα επίπεδα mRNA. Η μελέτη της επίδρασης χημειοθεραπευτικών παραγόντων στα καρκινικά κύτταρα στομάχου AGS με τη συμβατική PCR αποκάλυψε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του γονίδιου BCL2L12. Ακόμη μεγαλύτερες μεταβολές παρατηρήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου DDC σχεδόν σε όλα τα φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν. Επιπλέον, οι μεθοδολογίες ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qReal-Time PCR), για τα γονίδια DDC και BCL2L12 επιβεβαίωσαν την πλειονότητα των ευρημάτων της μεθόδου RT-PCR. Τα ευρήματα ανέδειξαν τη σημασία των γονιδίων BCL2L12 και DDC στην επιλογή της καταλληλότερης χημειοθεραπευτικής αγωγής με μελλοντικό στόχο την αποτελεσματικότερη αντιμετώπισή της.