Ενδοκλωνική ετερογένεια των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και συσχέτισή της με ιικά αντιγόνα

Abstract

B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a clonal expansion of CD5+ B lymphocytes that accumulate in peripheral blood and lymphoid organs. The recent detection of different subsets of patients with CLL expressing stereotyped BCRs at variance with mathematical probability indicates an undisputed role for antigen selection in the pathogenesis of CLL. Although the study of SHM put a step forward in clarifying CLL pathogenesis by underlying the antigen-driven model, deeper analyses and further studies are necessary in order to specify: i) the exact microenvironment where antigen encounters the B-CLL precursor ii) the nature of this interaction iii) the duration of the exposure to the antigenic stimulus iv) the stage of B-cell development where leukemic transformation occurred. In this context, intraclonal diversification analysis of IG genes could provide a definite anSWEr to a fundamental issue: Is antigen involvement restricted in the malignant transformation phase or the putative antigen(s) continuously triggers the CLL clone and affects not only the progenitor but the leukemic clone as well? The study of intraclonal diversification (ID) of Ig genes has provided valuable insight into the pathogenesis and ontogenetic derivation of many B cell lymphoproliferative disorders.The presence or absence of ID can indicate the stage of malignant transformation, provide evidence for clonal evolution and define the molecular mechanism of the disease. However,the available data on ID within IG genes in CLL is limited and conflicting. We conducted an extensive study of ID in IG genes of patients with CLL aiming at gaining insight into: i) the operation of the SHM mechanism in CLL ii) the presence of ID in CLL patients of diverse mutational status iii) a possible correlation between ID and IGHV gene repertoire iv) molecular traits of the ID process such as the type (R/S) and distribution of ongoing mutations v) the incidence of ID both in heavy and light chains vi) underlaid patterns in ID process among ID-positive CLL cases suggesting a certain type of antigenic epitope. The present study can be subdivided into three phases: i) firstly, we explored the incidence of ID in a large series of ΙGKV-J/IGLV-J rearrangements, ii) secondly, we performed ID analysis for IGHV-D-J rearrangements of subset #4 cases, iii) finally, we sought evidence for persistent infection by EBV and CMV in a subset of CLL cases with distinctive ID patterns. Ι.Intraclonal diversification analysis of ΙGKV-J/IGLV-J rearrangements In the present study we followed a very stringent methodology and conducted a comprehensive analysis of ID in IGKV/IGLV genes of diverse mutational status from 57 rearrangements (37 ΙGKV-J, 20 IGLV-J). We demonstrate that ID can be present in rearranged IGKV/IGLV genes of a significant proportion of CLL cases. More importantly, however, the extent and possible functional impact of the ID process was found to be significantly more pronounced among cases with stereotypical IGs, especially those cases belonging to subset #4 with IGHV4-34/IGKV2-30 BCRs. Furthermore, our analysis revealed that ID process exhibits both similarities and differences with the “canonical” SHM mechanism. Interestingly, the most strinking ID patterns in subset #4 cases were observed within KFR4 and thus this region was considered as a major hotspot for ID targeting. In subset #4 cases, the observed patterns of intraclonal diversity among sets of subloned sequences attest to the very precise targeting of the ID process and may be considered as evidence for a stereotypical response to an active, ongoing interaction with antigen. ΙΙ.Intraclonal diversification analysis of stereotyped subset #4 IGΗV-D-J rearrangements We evaluated the intraclonal diversity (ID) status of IGHV genes in 10 CLL cases expressing IGHV4- 34/IGKV2-30 stereotyped BCRs (subset #4). All 10 subset #4 cases carried confirmed ID and exhibit edstereotyped patterns of ongoing mutations. Comparative analysis of normalized mutation frequencies between light and heavy chains analysis in subset #4 revealed that IGHV-D-J rearrangements were more heavily affected by the ID process. Analysis in both heavy and light chains revealed similar features of the underlying ID mechanism. Interestingly, HFR4 was recognized as primary target of ID process suggesting an “non canonical SHM”-like process. Moreover, stereotyped patterns of ID suggest that both heavy and light chains play an important and complementary role in antigen recognition. ΙΙΙ. Antigen stimulation in CLL: herpesviruses detection We sought evidence for persistent infection by EBV and CMV in CLL cases expressing the IGHV4-34 gene. The study group included 93 CLL cases with an intentional bias for the IGHV4-34 gene (23/93 cases). A median of 3 (2-9) peripheral blood samples per case (overall 356 samples) were tested overtime by Real-Time PCR for the presence of CMV/EBV DNA. The threshold value was based on estimations for viral load corresponding to active (as opposed to latent) infection. Cases were considered as CMV/EBV positive only if two or more samples from different time-points exceeded the real-time PCR threshold. Based on Real-Time PCR results for CMV/EBV DNA, cases were assigned to three subgroups: i) subgroup A: 59/93 double negative cases; (ii) subgroup B: 25/93 single positive cases (EBV-positive or CMV-positive); (iii) subgroup C: 9/93 double positive cases (EBV/CMV-positive). Striking differences regarding IGHV gene repertoire were observed between the three subgroups. In particular, the double negative subgroup was characterized by diverse IGHV gene usage (21 different IGHV genes) and a low frequency of the IGHV4-34 gene (5/59 cases; 8,47%). In contrast, the single positive subgroup utilized 12 different IGHV genes, with a bias for IGHV4-34 (9/25 cases; 36%). Finally, all nine double positive cases utilized the IGHV4-34 gene; remarkably, 7/9 double-positive IGHV4-34 cases expressed the major BCR stereotype as described above (subset #4). These cases were uniformly negative for CD38 and ZAP-70, frequently carried deletion 13q as the sole cytogenetic aberration and had a young age at diagnosis. On these grounds, we hypothesize that stimulation of CLL progenitor cells carrying distinctive IGHV4-34 BCRs by viral antigens/superantigens might facilitate clonal expansion and, eventually, leukemic transformation.

Η μελέτη της ενδοκλωνικής ετερογένειας (EE) των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών αποτελεί πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη της οντογένεσης των λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων καθώς η παρουσία ή απουσία επιπρόσθετων σωματικών μεταλλάξεων είναι ενδεικτική του σταδίου της νεοπλασματικής εξαλλαγής και παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την κλωνική εξέλιξη και το μοριακό μηχανισμό της νόσου. Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο κοινή μορφή λευχαιμίας στο Δυτικό κόσμο. Παρά την έντονη σχετική δραστηριότητα, τα βιβλιογραφικά δεδομένα αναφορικά με την ΕΕ των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στη ΧΛΛ είναι ανεπαρκή και αντιφατικά. Σε αυτό το πλαίσιο, στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε διεξοδική ανάλυση της ΕΕ σε αναδιατάξεις γονιδίων ανοσοσφαιρινών ασθενών με ΧΛΛ. Βασικές επιδιώξεις της μελέτης ήταν: i) να αποσαφηνιστεί εάν ο μηχανισμός της ΣΥΜ παραμένει λειτουργικός στα ΧΛΛ κύτταρα, ii) να προσδιοριστεί ο βαθμός ΕΕ σε ΧΛΛ ασθενείς με ποικίλο φορτίο μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV, iii) να αναδειχθούν πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της παρουσίας ΕΕ και του ρεπερτορίου γονιδίων IGHV/IGKV/IGLV, iv) να αναγνωριστούν τα μοριακά χαρακτηριστικά της διαδικασίας εισαγωγής νέων μεταλλάξεων. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη αποσκοπούσε στην αξιολόγηση της ΕΕ τόσο στα γονίδια τόσο των βαριών όσο και των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών και στην αναγνώριση πιθανών προτύπων ΕΕ ενδεικτικών για τον τύπο της αντιγονικής διέγερσης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε τρεις φάσεις: Ι.Μελέτη ενδοκλωνικής ετερογένειας σε αναδιατάξεις ΙGKV-J/IGLV-J Πραγματοποιήθηκε ευρείας κλίμακας υποκλωνοποίηση με αυστηρά κριτήρια κατά τον πειραματικό σχεδιασμό και την ανάλυση των αποτελεσμάτων για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των ελαφριών αλυσίδων στην επαφή με το αντιγόνο. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 57 αναδιατάξεις (37 ΙGKV-J και 20 IGLV-J) ποικίλου φορτίου μεταλλάξεων. Στις αναδιατάξεις IGKV-J, η ανάλυση της ΕΕ ανέδειξε μοναδικά πρότυπα επιπρόσθετων μεταλλάξεων στους ασθενείς του στερεότυπου υποσυνόλου #4. Ο μηχανισμός της ΕΕ παρουσίαζε τόσο ομοιότητες όσο και διαφορές σε σχέση με τον κλασικό μηχανισμό της ΣΥΜ. Ιδιαίτερα εντυπωσιακό ήταν το γεγονός ότι ως «επίκεντρο» της ΕΕ αναδείχθηκε η περιοχή KFR4. Στις αναδιατάξεις IGLV-J, η ΕΕ ήταν λιγότερο έντονη, αλλά ωστόσο σημαντική, καθώς 30% των ασθενών έφεραν τουλάχιστον μια CM. Εκτός των αναδιατάξεων των γονιδίων IGKV2-30 και IGLV3-21 σε ασθενείς των στερεότυπων υποσυνόλων #2 και #4, αντιστοίχως, η ΕΕ στις υπόλοιπες αναδιατάξεις IGKV-J και IGLV-J ήταν εξαιρετικά περιορισμένη. Συνεπώς, η στερεοτυπία στις ελαφριές αλυσίδες δεν αφορά μόνο σε στερεότυπα πρότυπα μεταλλάξεων αλλά και σε στερεότυπα πρότυπα επιπρόσθετων μεταλλάξεων στο πλαίσιο του φαινομένου της ΕΕ τονίζοντας το ρόλο της αντιγονικής διέγερσης ιδιαίτερα στους ασθενείς των στερεότυπων υποσυνόλων. ΙΙ.Μελέτη ενδοκλωνικής ετερογένειας σε αναδιατάξεις ΙGΗV-D-J ασθενών του στερεότυπου υποσυνόλου #4 Οι αναδιατάξεις των βαριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών 10 ασθενών του στερεότυπου υποσυνόλου #4 υποβλήθηκαν σε υποκλωνοποίηση ευρείας κλίμακας και ανάλυση ΕΕ. Η εν λόγω ανάλυση έδειξε ότι όλοι οι ασθενείς εμφάνιζαν επιβεβαιωμένη ΕΕ και εντυπωσιακά στερεότυπα πρότυπα επιπρόσθετων μεταλλάξεων. Από μηχανιστική άποψη, και σε αυτή τη φάση της μελέτης αποδείχθηκε ότι το φαινόμενο της ΕΕ παρουσιάζει διακριτά χαρακτηριστικά: ομοιότητες με το μηχανισμό της ΣΥΜ σε θέματα στόχευσης, διαφορές σε σχέση με τα επίκεντρα και την κατανομή των μεταλλάξεων. Τα κοινά πρότυπα στο είδος, τη φύση και την κατανομή των επιπρόσθετων μεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν στις δύο φάσεις της μελέτης (ελαφριές-βαριές αλυσίδες) υποδηλώνουν ότι η ΕΕ συμβαίνει με ειδικό μηχανισμό που στοχεύει εκλεκτικά συγκεκριμένες περιοχές του μορίου. Ιδιαίτερα εντυπωσιακό ήταν το γεγονός ότι ως «επίκεντρο» της ΕΕ αναδείχθηκε η περιοχή ΗFR4. Τα στερεότυπα ευρήματα στις βαριές αλυσίδες παράλληλα με τα στερεότυπα πρότυπα μεταλλάξεων στις ελαφριές αλυσίδες προτείνουν ότι ολόκληρο το μόριο της ανοσοσφαιρίνης υπόκειται στη διαδικασία της ΕΕ και η αναγνώριση του αντιγόνου πιθανότατα διαμεσολαβείται συνεργατικά από επιφάνειες αλληλεπίδρασης στις οποίες συμμετέχουν αμινοξέα τόσο των ελαφριών όσο και των βαριών αλυσίδων. ΙΙΙ. Αντιγονική διέγερση στη ΧΛΛ: μοριακές ενδείξεις για τον πιθανό ρόλο κοινών ερπητοϊών Δείγματα αίματος 93 ασθενών ΧΛΛ ελέγχθηκαν αναδρομικά για την παρουσία των ιών CMV και ΕΒV. Είκοσι τρεις ασθενείς της παρούσας μελέτης εξέφραζαν το γονίδιο IGHV4-34, ενώ οι υπόλοιποι πολλά διαφορετικά γονίδια IGHV. Στην IGHV4-34 (+) υποομάδα, 9/23 και 2/23 ασθενείς, αντιστοίχως, ανήκαν σε δύο διαφορετικά υποσύνολα με στερεότυπους BCRs (υποσύνολο #4: IGHV4-34/IGKV2-30, υποσύνολο #16: IGHV4-34/IGKV3-20). Για κάθε ασθενή ελέγχθηκαν 2-10 δείγματα (διάμεση τιμή 4, σύνολο 356) περιφερικού αίματος από διαφορετικές χρονικές στιγμές με τη μέθοδο της Real-Time PCR. Θετικοί κρίθηκαν οι ασθενείς με δύο τουλάχιστον θετικά δείγματα από διαφορετικά στιγμιότυπα. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε τρεις διακριτές υποομάδες ανάλογα με το πρότυπο θετικότητας: (i) Υποομάδα Α: 59/93 ασθενείς αρνητικοί για CMV/EBV, (ii) Υποομάδα Β: 25/93 ασθενείς θετικοί για έναν από τους δύο ιούς (EBV-/CMV+ ή ΕΒV+/CMV-), (iii) Υποομάδα Γ: 9/93 ασθενείς θετικοί και για τους δύο ερπητοϊούς (CMV+EBV+). Ιδιαίτερα σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των τριών υποομάδων αναφορικά με τη χρήση των γονιδίων IGHV. Ειδικότερα, στην υποομάδα Α παρατηρήθηκε ετερογενές ρεπερτόριο, ενώ αντίθετα στην υποομάδα Β παρατηρήθηκε υπεραντιπροσώπευση του γονιδίου IGHV4-34 (9/25 περιπτώσεις; 36%). Oι ασθενείς της υποομάδα Γ παρουσίαζαν ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς περιλάμβανε αποκλειστικά IGHV4-34 (+) ασθενείς. Μάλιστα, 7/9 CMV+EBV+ ασθενείς της υποομάδας Γ εξέφραζαν στερεότυπο υποδοχέα IGHV4-34/IGKV2-30 με αλληλουχία HCDR3 συμβατή με πιθανή δράση anti-DNA αυτοαντισώματος. Οι συγκεκριμένοι ασθενείς εμφάνιζαν επίσης αξιοσημείωτη κλινικο-βιολογική στερεοτυπία υπό την έννοια (i) καθολικής έκφρασης ισοτύπου IgG, (ii) παρουσίας ελλειμμάτων του χρωμοσώματος 13q ως μοναδικής κυτταρογενετικής βλάβης, (iii) συχνής έκφρασης αυτοαντισωμάτων, (iv) σημαντικά μικρότερης ηλικίας κατά τη διάγνωση συγκριτικά με το σύνολο των ασθενών και (v) πολύ ήπιας κλινικής πορείας. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη αναδεικνύει διπλοθετικότητα για τους ερπητοϊούς CMV/EBV σε ασθενείς ΧΛΛ που χρησιμοποιούν αποκλειστικά το γονίδιο IGHV4-34 και εγείρει ερωτήματα για τον υποκείμενο μοριακό μηχανισμό και την πιθανή γενετική προδιάθεση των ασθενών σε υπέρμετρη και τελικά απορυθμισμένη ανοσοαπόκριση, που ίσως οδηγεί σε λευχαιμική εξαλλαγή.