Μελέτες επί της δομής και της λειτουργίας του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από το Dictyostelium discoideum

Abstract

Ribonuclease Ρ is a ubiquitus ribonucleoprotein enzyme responsible for the production of the 5’ mature ends of all precursor tRNA molecules RNase Ρ endonucleolytic activity has been isolated from organisms representing the three domains of life namely Bacteria, Archaea, and Eukarya. It has been shown to contain an essential RNA subunit and one (Bacteria) or more (Archaea, Eukaryotes) proteins. The RNase Ρ RNA subunits from bacteria and some archaea are catalytically active in vitro, whereas those from eukaryotes and most archaea have lost most of their functionality and require protein subunits for activity. RNase Ρ has been characterized biochemically and genetically in several systems and structures for both RNA and protein subunits have emerged. The integration of structural and functional data is slowly forming a scenario for the evolution of RNase Ρ from an ancient enzyme to a highly organized ribonucleoprotein complex. Dictyostelium discoideum RNase Ρ harbors an essential RNA subunit, and has high protein content, as judged by its low boyant density. Nevertheless, our knowledge on the exact composition was limited. In the current study a gene showing significant similarity to human Rpp30 RNase Ρ protein subunit was identified in Dictyostelium genome. The gene encodes a protein (DRpp30) which is significantly larger than its homologues, due to an unusual C-terminus. The gene was cloned, overexpressed, and was used for the production of polyclonal antibodies. The participation of DRpp30 in the macromolecular complex of RNase Ρ was verified by an immunobiochemical approach. The recombinant protein was shown to bind specifically both the RNase Ρ RNA subunit and the pre-tRNA substrate in vitro, thus giving a first insight of its role in the holoenzyme complex. Homology modeling using as a template the archaeal Ph1887p, and molecular dynamics simulations of the modeled structure suggest that DRpp30 adopts a TIM-barrel fold. While our efforts to isolate the gene encoding the RNA subunit of D. discoideum RNase Ρ were in progress, Norman Pace and his group identified it through phylogenetic comparison. The full transcript of the gene was detected in active RNase Ρ samples along with a smaller transcript of the same gene. The exact 5’ and 3’ ends of both transcripts were identified and were cloned. Both these transcripts can substitute the endogenous RNA subunit in vitro, but no enzymatic activity associated with these RNA molecules could be detected so far.

Η ριβονουκλεάση Ρ είναι το ένζυμο το οποίο αναλαμβάνει την δημιουργία του 5’ ώριμου άκρου όλων των προδρόμων μορίων tRNA. Πρόκειται για ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο εντοπίζεται στα κύτταρα των οργανισμών και από τις τρεις κυρίες φυλογενετικές περιοχές, τα Βακτήρια, τα Αρχαία και τους Ευκαρυώτες. Αποτελείται από μια υπομονάδα RNA απαραίτητη για την κατάλυση, ενώ το μέγεθος και ο αριθμός των πρωτεϊνικών υπομονάδων ποικίλλει από μια μικρή στα βακτήρια έως δέκα πρωτεΐνες στο ολοένζυμο που απομονώνεται από τα ανθρωπινά κύτταρα. Οι υπομονάδες RNA των βακτηρίων καθώς επίσης και μερικών αρχαίων μπορούν να καταλύσουν την αντίδραση ωρίμανσης του tRNA απουσία της πρωτεΐνης in vitro είναι δηλαδή ριβοένζυμα. Η ανακάλυψη αυτή διεύρυνε τις αντιλήψεις μας για τις ιδιότητες των βιομορίων και επανέφερε στο προσκήνιο την θεωρία του κόσμου του RNA. Στο ευκαρυωτικό ριβοένζυμο ο ρόλος των πρωτεϊνών είναι πιο ουσιαστικός καθώς η υπομονάδα RNA φαίνεται ότι χάνει μεγάλο μέρος της λειτουργικής της ανεξαρτησίας. Η διαλεύκανση των λειτουργών της κάθε υπομονάδας θα δώσει σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη της RNase Ρ από ένα αρχέγονο ένζυμο σε ένα πολύπλοκο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. Η RNase Ρ από το Dictyostelium discoideum διαθέτει μια απαραίτητη για την δραστικότητα υπομονάδα RNA όπως και όλα τα ένζυμα αυτού του είδους. Παράλληλα διαθέτει έντονο πρωτεϊνικό χαρακτήρα καθώς διαθέτει την χαμηλότερη πυκνότητα επιπολής σε σχέση με ένζυμα RNase Ρ από άλλους οργανισμούς. Οι πληροφορίες αυτές προέρχονται από τον αρχικό χαρακτηρισμό του ενζυμικού συμπλόκου, και δεν παρέχουν στοιχεία για την ακριβή σύστασή του. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός ενός από τα γονίδια που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του Dictyostelium, ομόλογα προς χαρακτηρισμένα γονίδια από τον άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες. Το γονίδιο drpp30 κωδικεύει μια πρωτεΐνη 40.7 kDa, σημαντικά μεγαλύτερη από τις ομόλογές της. Η πρωτεΐνη DRpp30 υπερεκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα, και μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό της χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Η συμμέτοχη της DRpp30 στο μακρομοριακό σύμπλοκο της RNase Ρ πιστοποιήθηκε με ανοσοβιοχημική προσέγγιση, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη προσδένει το pre-tRNA υπόστρωμα του ένζυμου καθώς και την υπομονάδα RNA in vitro. Το μοντέλο ομολογίας της DRpp30 βάσει της κρυσταλλικής δομής της ορθόλογης Ρh1877 από τα αρχαία φανερώνει ότι η πρωτεΐνη αποκτά τη δομή αβ βαρελιού (TIM barrel fold). Κατά τη διάρκεια της διατριβής οι προσπάθειες για τον εντοπισμό του γονίδιου της RNA υπομονάδας ήταν σε εξέλιξη όταν το εν λόγω γονίδιο αναγνωρίστηκε μέσω φυλογενετικών συγκρίσεων από την ομάδα του Norman Pace. Το μετάγραφο του γονίδιου εντοπίστηκε σε ενεργά κλάσματα RNase Ρ, και παράλληλα εντοπίστηκε και ένα μικρότερο μετάγραφο του ίδιου γονίδιου. Προσδιορίστηκαν τα ακριβή 5’ και 3’ άκρα των δύο αυτών μορίων και ακολούθησε κλωνοποίησή τους. Τα in vitro μετάγραφα των δύο κλωνοποιημένων αλληλουχιών μπορούν να υποκαθιστούν την ενδογενή RNA υπομονάδα του ολοενζύμου in vitro, ενώ δεν εντοπίστηκε έως τώρα ενζυμική δραστικότητα που να σχετίζεται με τα δυο αυτά μόρια.