Επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών επί της πρωτεϊνοσύνθεσης και επί εξωριβοσωματικών λειτουργιών του ευκαρυωτικού κυττάρου

Abstract

The aim of the present diatribe focuses on the function and structure of the eukaryotic ribosome. Specifically the influence of several ribosomal RNA (rRNA) residues from the small and the large ribosomal subunits and of several extra ribosomal elements on the accurate decoding of the genetic information the catalysis of peptide bond formation and the translocation of peptidyl tRNA from the A to Ρ ribosomal site were investigated. Finally the possible correlation between translational fidelity and the cell’s oxidative status was determined for the first time in eukaryotic cells. The methodology applied includes: a) the error frequency (E F) determination that measures translational fidelity, b) the determination of the catalytic rate constant for peptide bond formation that reflects the ribosomal peptidyltransferase activity and c) the dependence of the translocation step on soluble protein factors concentration and on cycloheximide concentration. Moreover we studied the effects of the antibiotics paromomycin and cycloheximide in vivo and in vitro. The assembly of ribosomal subunits ribosomes and polysomes was also investigated. Finally typical markers of the cell’s oxidative status were determined. Despite the fact that rRNA residues are mainly responsible for ribosomal function the results from the first part of the thesis lead to the conclusion that translational fidelity catalytic activity and the translocation step of translation are partially affected by extra ribosomal elements such as the serine/threonine phosphatase SAL6 as well as the ASU9 gene product. The conclusions drawn from the second part of the diatribe point to the constant intercommunication between the two ribosomal subunits. Indeed several mutations in the small ribosomal subunit rRNA not only affect its major function i.e. the decoding process but also the rate of peptide bond formation. Reversely several mutations in the large ribosomal subunit rRNA not only affect its major activity i.e. peptidyltransferase activity but also the accuracy of decoding. Some of these mutations influence in addition the translocation step of protein synthesis. In the third part we prove that error prone mutations display lower oxidative stress whereas the hyperaccurate mutations display higher oxidative stress. An attractive interpretation of these results is that a cell might spend more energy in order to achieve hyperaccuracy during translation thus reducing the amount of energy left in order to combat free radicals.

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής εστιάζεται στη διερεύνηση της λειτουργίας και της δομής του ευκαρυωτικού ριβοσώματος. Συγκεκριμένα ερευνά την επίδραση ορισμένων συστατικών του ριβοσωματικού RNA (rRNA) της μεγάλης και της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος αλλά και ορισμένων εξωριβοσωματικών συστατικών επί της πιστής αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας επί της ικανότητας κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού άλλα και επί της μετατόπισης του πεπτίδυλο tRNA από την Α στην Ρ ριβοσωματικη περιοχή. Τέλος διερευνήθηκε για πρώτη φορά σε ευκαρυωτικά κύτταρα η πιθανότητα συσχέτισης της πιστότητας με την οποία επιτελούν τα κύτταρα τη μετάφραση με την οξειδωτική τους κατάσταση. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε περιλαμβάνει: α) τον προσδιορισμό της συχνότητας λάθους (EF) in vitro η οποία αποτελεί μέτρο της πιστότητας της μετάφρασης, β) τον προσδιορισμό της ταχύτητας κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού που αποτελεί μέτρο της ενεργότητας της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης και γ) την εξάρτηση του σταδίου μετατόπισης από την συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων και του κυκλοεξιμιδίου. Επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση ορισμένων αντιβιοτικών κυρίως της παρομομυκίνης και του κυκλοεξιμιδίου in νινο και in vitro. Επίσης προσδιορίστηκε η ικανότητα συγκρότησης των ριβοσωματικών υπομονάδων των ακέραιων ριβοσωμάτων και των πολυσωμάτων. Τέλος προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί δείκτες της οξειδωτικής κατάστασης του κυττάρου. Πάρα το γεγονός ότι συστατικά του rRNA είναι κυρίως υπεύθυνα για τη ριβοσωματική λειτουργία τα αποτελέσματα της πρώτης ενότητας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πιστότητα της μετάφρασης η καταλυτική ενεργότητα άλλα και το στάδιο μετατόπισης της μετάφρασης επηρεάζονται ως ένα βαθμό και από εξωριβοσωματικά συστατικά όπως είναι η φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 και το προϊόν του γονίδιου ASU9. Τα συμπεράσματα της δεύτερης θεματικής ενότητας δίνουν έμφαση στην συνεχή ενδοεπικοινωνία που υφίσταται μεταξύ των δύο ριβοσωματικών υπομονάδων. Πράγματι, ορισμένες μεταλλάξεις στο rRNA της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος επηρεάζουν έκτος από την κύρια λειτουργία αυτής δηλαδή την αποκωδικοποίηση και την ταχύτητα σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών. Αντίστροφα ορισμένες μεταλλάξεις στο rRNA της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος επηρεάζουν έκτος από την κυρία ενεργότητα αυτής δηλαδή την ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης και την πιστότητα της αποκωδικοποίησης. Ορισμένες εξ αυτών των μεταλλάξεων επηρεάζουν επίσης και το στάδιο της μετατόπισης. Στην τρίτη ενότητα αποδεικνύουμε ότι οι επιρρεπείς σε λάθη μεταλλάξεις παρουσιάζουν χαμηλότερο οξειδωτικό στρες ενώ οι υπερακριβείς μεταλλάξεις παρουσιάζουν υψηλότερο οξειδωτικό στρες. Μια ελκυστική ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι ότι όσο πιο υπερακριβές είναι ένα κύτταρο κατά τη μετάφραση τόσο περισσότερο είναι το ποσό της ενέργειας που πρέπει να καταναλώσει ώστε να εξασφαλίσει την αποφυγή λαθών κατά τη πρωτεϊνοσύνθεση ελαττώνοντας κατά αυτό τον τρόπο το ποσό ενέργειας με το οποίο θα αντιμετωπίζονταν οι ελεύθερες ρίζες.