Διερεύνηση του ρόλου της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου Escherichia coli

Abstract

The aim of this thesis was to investigate the role of 5S rRNA configuration in protein synthesis of the enterobacterium E. coli. At the same time the biological activity of polyamines in the structure and functioning of both 5S rRNA and the whole ribosomal complex was studied. Polyamine binding to 5S rRNA was investigated by photoaffinity labeling. Kinetic study was performed and the number of cross-linking sites of ABA-spermine were determined. The results revealed that in free 5S rRNA spermine binds mainly to nucleotides of helices III and V and loops A, C, D and Ε. The impact of the ΑΒΑ-spermine photo-incorporation into the 5S rRNA molecule was then investigated. Chemical modification experiments revealed that loop A adopts a "looser' structure, while loops C, D, Ε and helices III and V achieve a more compact folding. The effect of changing the configuration of 5S rRNA on 50S subunit and 70S ribosomal complex assembly was investigated. The results showed that binding of ABA-spermine to 5S rRNA does not eliminate the process of 50S subunit assembly. Next, the effect of photolabeling 5S rRNA was studied, initially on the ability of ribosomes to bind substrate, and then on their catalytic activity. Photolabeling of 5S rRNA with ΑΒΑ-spermine caused a small but obvious activation in AcPhe-tRNA binding to the P-site. In contrast, binding to the Α-site did not appear to be affected. The effect on the activity of peptidyl-transferase showed an increase of up to 30% on the activity of PTase in the presence of spermine. The study of the effect of 5S rRNA conformational changes on ribosome's ability to translocate substrates followed. It was shown that binding of spermine to 5S rRNA stimulates non-enzymatic translocation while the presence of spermine in 5S rRNA reduced the requirements for EF-G. We also studied the ribosomal ability to bind EF-G and then the ability to trigger EF-G-dependent GTP hydrolysis. It was found that the presence of spermine in 5S rRNA promotes EF-G binding to ribosomes and that the initial rate of GTP hydrolysis was not influenced by the presence of spermine. The effect of the ionic environment and the changes in the tertiary structure of 5S rRNA on the conformational state of fundamental functional centres in the ribosome followed. Specifically, the study was focused on the ability of free spermine or photolabeling 5S rRNA with ΑΒΑ-spermine to affect the SRL and GAC regions of the ribosome as well as the A-and P-sites. It was found that interaction of free spermine with ribosomes intensifies the footprint of EF-G within the ribosome and induces the AcPhe-tRNA binding to the P-site but not to the A-site. In summary, a comprehensive view of the 5S rRNA nucleotide residues involved in spermine binding is gained by the present study. The results further suggest that binding of spermine to 5S rRNA causes conformational changes in certain regions of the molecule. These changes, although not of the extreme amplitude, enabled us to investigate the functional role of 5S rRNA. In light of this role, it seems that PTase center and EF-G binding center are able to coordinate their functions by transmission of allosteric signals through 5S rRNA.

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E. coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rRNA, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου. Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε ελεύθερο 5S rRNA η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων ΙΙΙ και V και στις θηλιές A, C, D και Ε. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rRNA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή ενώ οι θηλιές C, D και Ε και η έλικα ΙΙΙ μια πιο συνεκτική δομή. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα του να συναρμολογείτε σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA, παρεμποδίζει τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rRNA. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της φωτοσήμανσης του 5S rRNA, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rRNA με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν επίσης, η επίδραση στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην μετατόπιση υποστρωμάτων αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rRNA διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rRNA, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση έδειξε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rRNA ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα ενώ τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος και της αλλαγής της διαμόρφωσης του 5S rRNA στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rRNA να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EFG στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Βρέθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπεύθυνων για την πρόσδεση του EF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θεσης. Συμπερασματικά, το 5S rRNA περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rRNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rRNA φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG.