Προσδιορισμός των γενότυπων προβάτων ως προς το γονίδιο της τρομώδους νόσου (scrapie) με βάση το DNA των σωματικών κυττάρων του γάλατος και σχέση μεταξύ γενότυπων και ζωοτεχνικών χαρακτηριστικών

Abstract

1.013 individual ovine milk samples were collected from as many purebred Chios ewes raised in 23 flocks-members of the national Chios Sheep Breeder’s Cooperative. Genomic DNA was extracted from milk somatic cells using a modified commercially available extraction kit, optimised for ovine milk. Genotyping at codons 136, 154, and 171 (classical scrapie) and 141 (atypical scrapie) was performed using a PCR- RFLP analysis protocol. A total of 15 genotypes and 6 alleles (ARQ, AHQ, TRQ, ARR, ARH, VRQ) linked to codons 136, 154 and 171 were detected. Allelic frequencies were 76.1%, 8.2%, 7.7%, 6.9%, 0.7% and 0.4% for ARQ, AHQ, TRQ, ARR, ARH and VRQ, respectively. All animals were homozygous for the leucine allele at codon 141. Αrtificial bulk milk samples were created in the lab by mixing individual milk samples from ewes with known genotypes. Genomic DNA was extracted from these samples using the Modified blood kit. PRNP genotyping was performed in the artificial bulk milk samples using a similar PCR-RFLP analysis protocol. In addition, standard samples were constructed by plasmid DNA and equimolar DNA extracts in order to determine the detection limit (LOD) of each PRNP allele with RFLP analysis. Results showed that LOD of VRQ and AHQ is 0.5%, ARR and ARH is 4% and TRQ is 8%. Furthermore, the impact of the PRNP gene locus on milk production (test-day and total lactation yield) and reproduction (age at first lambing, conception rate at first service and prolificacy) of Chios sheep was assessed using mixed linear models. The association studies were based on records obtained from the official dataset of Chios Sheep Breeder’s Cooperative «Macedonia». The ARQ allele was found to have a favourable effect on conception rate at first service and age at first lambing. The TRQ allele, whose association with such traits was assessed for the first time, had a positive effect on test-day milk yield and an adverse effect on age at first lambing. Nevertheless, only the effect of TRQ on age at first lambing remained statistical significant after the correction with Bonferroni test. The ARR allele, which is associated with increased resistance to classical scrapie, had no significant effect on any of the traits studied. No significant associations of the PRNP genotypes with production and reproduction traits were observed. Selection for scrapie-resistant sheep is not expected to affect milk yield and reproduction of the Chios breed. Moreover, the proposed PCR-RFLP method, using bulk milk, can provide a useful test for fast screening of flocks for the presence of undesirable alleles such as VRQ or AHQ. In case, for example, that VRQ-carriers are detected in a flock, individual animal genotyping could then be performed to exclude these undesirable animals from flocks. In addition, milk somatic cells are a practical, animal friendly source of genomic DNA which could be used in order to facilitate the sampling for individual PRNP genotyping in a large scale application.

Από 1.013 προβατίνες φυλής Χίου, που εκτρέφονταν σε 23 ποίμνια, συλλέχθηκαν ατομικά δείγματα γάλατος. Από τα σωματικά κύτταρα του γάλατος απομονώθηκε DNA και έγινε γενοτυπικός προσδιορισμός των προβατινών για το γονίδιο της πρωτεΐνης-prion (PRNP). Ο προσδιορισμός των πολυμορφισμών στα κωδικόνια 136, 154, 141 και 171 του γονιδίου PRNP, που σχετίζονται με την ευπάθεια στην τρομώδη νόσο, έγινε με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης και της ανάλυσης πολυμορφισμού του μήκους περιοριστικών θραυσμάτων (PCR-RFLP). Ανιχνεύτηκαν 6 αλληλόμορφα ARQ, AHQ, TRQ, ARR, ARH και VRQ σε συχνότητες 76,1%, 8,2%, 7,7%, 6,9%, 0,7% και 0,4%, αντίστοιχα. Επιπλέον, όλες οι προβατίνες έφεραν στο κωδικόνιο 141 τον πολυμορφισμό λευκίνη. Απομόνωση DNA και προσδιορισμός γενοτύπων πραγματοποιήθηκαν με αντίστοιχες μεθόδους και σε ομαδικό επίπεδο, σε πειραματικά δείγματα που προσομοίαζαν με δείγματα γάλατος της δεξαμενής ψύξης του ποιμνίου. Τα δείγματα αυτά δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο με ανάμιξη ατομικών δειγμάτων νωπού γάλατος σε συγκεκριμένες, κάθε φορά, αναλογίες. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας της μεθόδου PCR-RFLP σε ομαδικό επίπεδο, δημιουργήθηκαν πρότυπα με ανάμιξη πλασμιδιακού DNA, καθώς και με ανάμιξη ισομοριακών απομονώσεων DNA των ζώων. Τα όρια ανίχνευσης του αλληλομόρφου ΑΗQ και VRQ στα ομαδικά δείγματα ήταν 0,5%, του ΑRH και του ΑRR 4%, ενώ του ΤRQ 8%. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης του γονιδίου PRNP στην ημερήσια γαλακτοπαραγωγή του μηνιαίου ελέγχου, στη συνολική γαλακτοπαραγωγή της γαλακτικής περιόδου, στο δείκτη πολυδυμίας, στο ρυθμό σύλληψης με την πρώτη οχεία, και στην ηλικία του ζώου στον πρώτο τοκετό των προβάτων φυλής Χίου με τη βοήθεια μικτών γραμμικών προτύπων. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα αποτελέσματα του γενοτυπικού προσδιορισμού των 1.013 προβατινών και μία βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε, για αυτά τα ζώα, με επίσημα στοιχεία που είχαν καταγραφεί από το συνεταιρισμό προβατοτρόφων φυλής Χίου «Μακεδονία». Το αλληλόμορφο ARQ, που είναι το συχνότερο στον πληθυσμό, βρέθηκε να έχει αρχικά ευνοϊκή γενετική σχέση με την αναπαραγωγική ικανότητα (P<0,05). Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά δεν επιβεβαιώθηκαν μετά τη διόρθωση που έγινε για τις πολλαπλές δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο Bonferroni. Το αλληλόμορφο TRQ βρέθηκε και μετά τη διόρθωση Bonferroni να σχετίζεται αρνητικά με την ηλικία του ζώου στον πρώτο τοκετό. Το αλληλόμορφο ARR, που έχει συσχετιστεί με αυξημένη ανθεκτικότητα στην τρομώδη νόσο, δε βρέθηκε να έχει κάποια σημαντική επίδραση σε κανένα από τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Επιπλέον, κανένας από τους γενοτύπους του γονιδίου PRNP δεν εμφάνισε κάποια στατιστικά σημαντική επίδραση στα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Τα εν λόγω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η εφαρμογή ενός προγράμματος γενετικής επιλογής για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στην τρομώδη νόσο δε θα επηρεάσει αρνητικά τη γαλακτοπαραγωγική και αναπαραγωγική ικανότητα των προβάτων φυλής Χίου. Επιπλέον, η μέθοδος PCR-RFLP, που αναπτύχθηκε για το γενοτυπικό προσδιορισμό σε ομαδικό επίπεδο, επιτρέπει τον εύκολο και γρήγορο εντοπισμό ποιμνίων με ζώα-φορείς ανεπιθύμητων αλληλομόρφων. Στα ποίμνια αυτά μπορεί να ακολουθήσει ατομικός προσδιορισμός για τον εντοπισμό και την απομάκρυνση των ανεπιθύμητων ζώων. H λήψη δειγμάτων γάλατος είναι πιο εύκολη, πιο γρήγορη και πιο φιλική μέθοδος δειγματοληψίας συγκριτικά με την αιμοληψία. Θα μπορούσε, λοιπόν, να χρησιμοποιηθεί για να διευκολυνθεί η συλλογή δειγμάτων στα πλαίσια ενός εκτεταμένου προγράμματος γενετικής επιλογής για την τρομώδη νόσο.