Μεταβολική μελέτη της παραγωγής βιοαιθανόλης από το γενετικά τροποποιημένο μύκητα Fusarium oxysporum

Abstract

Ethanol produced from lignocellulose is an environment-friendly alternative to fossil fuels. The filamentous fungus Fusarium oxysporum is known for its ability to ferment hexoses and pentoses directly to ethanol. During xylose fermentation an accumulation of sedoheptulose-7-phosphate was observed, which might indicate a limitation in the transaldolase reaction or a competition of glyceraldehyde-3-phosphate between pentose phosphate pathway and glycolysis, resulting in acetate production and reduced xylose consumption. Moreover, accumulation of glucose-1,6-diphosphate may indicate reduced activity of phosphoglucomutase, which is involved in the conversion of glucose-6-phosphate to glucose-1-phosphate via glucose-1,6-diphosphate, and hence potential difficulties of glucose to be channelled towards cell wall biosynthesis. Purification and characterization of transaldolase and phosphoglucomutase was studied. In the case of transaldolase, LC-MS/MS analysis provided peptide mass and sequence information, allowing us to identify the enzyme from F. oxysporum proteome. As long as phosphoglucomutase is concerned, the effect of different metals in enzyme’s activity was also studied. The information of purification and characterization of the two enzymes aimed at the construction of a genetically modified strain of F. oxysporum which would constitutively express both phosphoglucomutase and transaldolase. Three strains were constructed; ANPGM1 and ANPgM2 strains emerged from the heterologous expression of phosphoglucomutase of F. oxysporum while FF11 strain emerged from the homologous expression of phosphoglucomutase and transaldolase of F. oxysporum. Conversion of glucose, xylose, galactose and their mixtures to ethanol by the wild type strain (F3) and the genetically modified strains of F. oxysporum was investigated in flasks while glucose and xylose metabolism by F3 and FF11 strains was studied in batch fermentations. The cultivations were performed in two phases; an aerobic growth phase and a production phase (anaerobic/oxygen-limited). Growth characteristics were evaluated in both phases of F. oxysporum strains while intracellular metabolites were determined under batch bioreactors. As a result, the constitutive expression of the two enzymes increased ethanol and reduced acetate production in glucose. In the case of xylose the specific xylose uptake rate was increased while increased yields of acetate and xylitol were detected.

Πραγματοποιήθηκε μεταβολική μελέτη της παραγωγής βιοαιθανόλης από γενετικά τροποποιημένα στελέχη του μύκητα Fusarium oxysporum. Στόχος ήταν ο σχεδιασμός μιας αποτελεσματικής και γρήγορης διεργασίας χωρίς παραπροϊόντα. Ο μύκητας αυτός έχει την ικανότητα να ζυμώνει αποτελεσματικά εξόζες και πεντόζες. Εμφανίζει όμως χαμηλούς ρυθμούς μετατροπής σακχάρων και παραγωγής αιθανόλης αλλά και παραγωγή ξυλιτόλης και οξικού οξέος. Τα παραπάνω πιθανά υποδεικνύουν χαμηλές ενεργότητες του ενζύμου φωσφογλυκομουτάση (που ελέγχει την εισαγωγή σακχάρων στη γλυκόλυση και τη μετατροπή τους σε αιθανόλη) και τρανσαλδολάση (που ελέγχει την αναστολή του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών και εξηγεί πιθανά την παραγωγή οξικού οξέος). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση και χαρακτηρισμός της τρανσαλδολάσης και της φωσφογλυκομουτάσης. Για κάθε ένζυμο προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος, το ισοηλεκτρικό σημείο, οι συνθήκες pH και θερμοκρασίας που επηρεάζουν τη σταθερότητα και δράση του και ο μηχανισμός δράσης. Για την τρανσαλδολάση προσδιορίστηκε η αλληλουχία πεπτιδίων με ανάλυση nano-ESI-MS/MS, ενώ για τη φωσφογλυκομουτάση μελετήθηκε η επίδραση μετάλλων στη δραστικότητά της. Οι πληροφορίες από την απομόνωση και χαρακτηρισμό των ενζύμων στόχευαν στη δημιουργία ενός γενετικά τροποποιημένου στελέχους που θα υπερεκφράζει τα δύο ένζυμα. Κατασκευάστηκαν τα στελέχη ANPGM1 και ANPgM2 (με ετερόλογο ανασυνδυασμό του μύκητα F. oxysporum με το γονίδιο της φωσφογλυκομουτάσης του μύκητα Aspergillus nidulans) και το στέλεχος FF11 (με ομόλογο ανασυνδυασμό των γονιδίων της τρανσαλδολάσης και της φωσφογλυκομουτάσης, υπό τη ρύθμιση του ισχυρού υποκινητή συνεχούς έκφρασης του γονιδίου gpdΑ του A. nidulans). Μελετήθηκε ο μεταβολισμός της γλυκόζης, ξυλόζης, γαλακτόζης και μιγμάτων αυτών από το φυσικό και τα τροποποιημένα στελέχη σε ανακινούμενες φιάλες. Στο αερόβιο στάδιο της ανάπτυξης των στελεχών προσδιορίστηκε ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης και η απόδοση σε κυτταρική μάζα. Στη φάση παραγωγής αιθανόλης προσδιορίστηκαν: αιθανόλη, οξικό οξύ, γλυκερόλη, ηλεκτρικό οξύ και ξυλιτόλη. Μελετήθηκε ο μεταβολισμός της γλυκόζης και της ξυλόζης σε βιοαντιδραστήρες. Προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι, οι αποδόσεις των εξωκυτταρικών μεταβολιτών και οι εσωκυτταρικοί μεταβολίτες του φυσικού και του τροποποιημένου στελέχους FF11 του μύκητα F. oxysporum. Τελικά, η γενετική τροποποίηση αύξησε τα επίπεδα αιθανόλης μειώνοντας το παραγόμενο οξικό οξύ στη γλυκόζη, ενώ στην περίπτωση της ξυλόζης παρατηρήθηκε αύξηση στο ρυθμό μετατροπής αυτής.