Μελέτη της μικροδορυφορικής αστάθειας, των ενζύμων επιδιόρθωσης του DNA και του μονοπατιού της MAP κινάσης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως

Abstract

Aim of this study is the molecular and immunohistochemical study of urothelial bladder carcinomas, as well as the correlation with their clinicopathological characteristics and patients survival, in order to determine the potential association of these alterations in likely prognostic and diagnostic methods but also as means of follow-up of the disease. We studied MSI target genes TGF-βRII(A)₁₀, IGFIIR(G)₈, BAX(G)₈, caspase 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈ and hMSH6(G)₈ for the presence of mutations in their mononucleotide sequences and hMLH1, hMSH2 protein expression. We also analysed the presence of B-Raf gene mutations in relation to the activation of MAP kinase ERK. Molecular biology methods as well as immunohistochemistry were used in 152 tumor samples from patients with primary UC. At the present study 11 cases (16%) were mutated at TGF-βRII(A)₁₀, 1 case (3%) at BAX(G)₈ while no mutations were observed in caspase 5(A)₁₀, hMSH3(A)₈, hMSH6(G)₈ and IGFIIR(G)₈ by using PCR-SSCP and sequencing analysis. Nuclear hMLH1 and hMSH2 protein expression was found in 40/65 and 38/62 of the cases respectively by immunohistochemistry. Mutations in exon 15 of B-Raf gene were not detected in any of the examined cases. Nuclear or cytoplasmic immunoreactivity for pERK was detected in 99.3% (151/152) and 96.7% (147/152) of cases respectively. According to our results frameshift mutations at mononucleotide repeats in target genes of the microsatelhte instability pathway in urothelial carcinomas of the bladder are rarely observed in urinary bladder carcinogenesis in which the MSI pathway is rather uncommon. Nevertheless, hMLH1 protein expression is related to the presence of MSI and it is an important indicator for disease recurrence. Elevated pERK expression is observed in UCs in absence of B-Raf mutations. Interestingly, nuclear pERK expression parallels histologic grade and T-category in bladder UCs, implicating ERK activation in tumor invasiveness as well as in the acquisition of a more aggressive phenotype. These results speak in favor of the role of activated ERK as a molecular marker in the development of bladder cancer and encourage prospective investigations to validate the role of pERK as a therapeutic target in urothelial bladder cancer.

Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μοριακή και ανοσοϊστοχημική μελέτη του ουροθηλιακού καρκινώματος της ουροδόχου κύστεως καθώς και η συσχέτιση των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των όγκων και την επιβίωση των ασθενών, με στόχο να αναζητηθεί η πιθανή προγνωστική τους αξία η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί στη διάγνωση, την πρόβλεψη της εξέλιξης ή της υποτροπής της νόσου καθώς και στην ανάπτυξη νέων θεραπειών. Μελετήθηκαν οι μονο-νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των γονιδίων-στόχων της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII(A)₁₀, IGFIIR(G)₈, BAX(G)₈, κασπαση 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈ και hMSH6(G)₈ για την ύπαρξη μεταλλαγών και η έκφραση των πρωτεϊνών hMLH1 και hMSH2. Επιπλέον έγινε αναζήτηση της παρουσίας μεταλλαγών στο γονίδιο B-Raf και της ενεργοποίησης της MAP κινάσης ERK. Χρησιμοποιήθηκαν 152 δείγματα από ασθενείς με ουροθηλιακό καρκίνωμα ουροδόχου κύστεως, ενώ εφαρμόστηκαν μέθοδοι μοριακής βιολογίας και ανοσοϊστοχημείας. Παρατηρήθηκε σε 11 περιπτώσεις (16%) μεταλλαγή του γονιδίου TGF-βRII και σε 1 περίπτωση (3%) του γονιδίου ΒΑΧ. Αντιθέτως, δεν βρέθηκαν μεταλλαγές στις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες των γονίδιων κασπάση 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈, hMSH6(G)₈ και IGFIIR(G)₈. Ανοσοϊστοχημικά εντοπίστηκε πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης hMLH1 σε 40/65 περιπτώσεις και της hMSH2 σε 38/62 περιπτώσεις. Δεν παρατηρήθηκε μεταλλαγή του γονίδιου B-Raf ενώ πυρηνική χρώση της πρωτεΐνης pERK παρατηρήθηκε σε ποσοστό 99.3% (151/152 περιπτώσεις) και κυτταροπλασματική σε 96.7% (147/152 περιπτώσεις). Μπορούμε λοιπόν να εξάγουμε τα παρακάτω συμπεράσματα: η απενεργοποίηση του μηχανισμού επιδιόρθωσης λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων του DNA λόγω μεταλλαγής των γονιδίων επιδιόρθωσης που οδηγεί στην ανάπτυξη μικροδορυφορικής αστάθειας, εμπλέκεται σε μικρό ποσοστό στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστεως. Η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης hMLH1 φαίνεται να σχετίζεται στενά με την παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας, ενώ αναδείχθηκε σημαντικός προγνωστικός παράγοντας όσον αφορά την επανεμφάνιση της νόσου. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της ενεργοποιημένης MAP κινάσης ERK απουσία μεταλλαγών στο B-Raf. Η πυρηνική έκφραση της pERK αυξάνεται με το βαθμό διαφοροποίησης και την κατηγορία Τ του όγκου, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης ERK ενδεχομένως οδηγεί σε πιο επιθετικό φαινότυπο στο ουροθηλιακό καρκίνωμα ουροδόχου κύστεως. Με αυτόν τον τρόπο αναδεικνύεται η έκφραση της πρωτεΐνης pERK ως μοριακός δείκτης στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστεως και η πιθανή σημασία της ως θεραπευτικός στόχος για τα ουροθηλιακά καρκινώματα.