Ανίχνευση, κλωνοποίηση, μελέτη του προτύπου έκφρασης και λειτουργικός ρόλος του γονιδίου chick Nscl1

Abstract

Transcription factors of the bHLH family play a major role in cellular determination and differentiation. bHLH proteins have been classified in seven categories. Class I HLH proteins like ME1a, E2 and daughterless, are expressed in many tissues and are capable of forming either homo- or heterodimers. Class II HLH proteins, which include members such as Mash1, Math1, NeuroD and NSCL1, show a tissuerestricted expression pattern. With few exceptions, they cannot form homodimers and preferentially heterodimerize with the class I proteins. In the present study, the chick Nscl1 gene has been isolated with the aim of performing functional experiments in ovo. Chick NSCL1 consists of 130 aminoacids and shows a significant conservation with the human and mouse homologs, which consist of 133 aminoacids. They differ just in one aminoacid in the bHLH region, reaching 98% homology. Our experiments showed that cNscl1 is strictly expressed in neurons of the CNS and the PNS, like mouse and human homologs. Particularly, we observed that the Nscl1 is expressed in almost all the tissues of the nervous system such as the neural tube, the cranial and sensory ganglia, the hippocampus, the spinal cord, the diencephalon, the hindbrain and the cerebellum. In situ hybridization experiments showed that cNscl1 is only expressed in differentiating postmitotic neurons of the brain and the neural tube, while it is expressed in the cerebellum, in mitotic neuroblasts and postmitotic premigratory neurons of the external granule layer (EGL). In Hoxb1-/- mice we observed that Nscl1 expression is ceased in facial branchiomotor neurons (fbm). In Nscl1-/- mice a delay on the expression pattern is observed for Hoxb1, Hoxb2, Plzf and Engrailed-1 in the hindbrain, possibly due to a slowing down of differentiation of this region. Our results reveal novel sites of Nscl1 expression in mouse and chick. Nscl1 is expressed in rhombomeres, rhombomere boundaries and regenerated boundaries that are formed when an even numbered rhombomere is grafted next to an odd numbered rhombomere. Grafting an even (odd) numbered rhombomere next to another even (odd) numbered rhombomere, results in a single enlarged rhombomere that lacks the interrhombomeric boundary, and no Nscl1 expression is detected. In ovo injection and electroporation of the replication competent retrovirus RCAS(BP)-cNSCL1, and subsequent cNscl1 misexpression, results in abnormal brain development and small eye production. We furthermore studied the transcriptional activity of NSCL1 as a homodimer or as a heterodimeric complex with ME1a protein. We found out that homodimers of cNSCL1 fused to GAL4-DBD resulted in a strong reporter gene repression. On the contrary, heterodimers of mNSCL1 with ME1a bind to specific E-boxes and behave as transcriptional activators in reporter gene assays. The transcriptional capacity of NSCL1 should be localized in a basic region (b’) upstream of the bHLH domain

Oι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας bHLH κατέχουν κεντρικό ρόλο στις διαδικασίες του κυτταρικού καθορισμού και διαφοροποίησης. Οι bHLH πρωτεΐνες έχουν κατηγοριοποιηθεί σε επτά τάξεις. Η πρώτη τάξη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που εκφράζονται σε πολλούς ιστούς και σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή, όπως οι ME1a, E2 και daughterless. Η δεύτερη τάξη περιλαμβάνει μόρια που έχουν ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης όπως οι Mash1, Math1, NeuroD και NSCL1, και σχηματίζουν επί το πλείστον, ετεροδιμερή με μόρια της πρώτης τάξης. Kατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας έγινε δυνατή η απομόνωση του γονιδίου cNscl1 της όρνιθας. H πρωτεΐνη chick NSCL1, μεγέθους 130 αμινοξέων, παρουσιάζει πολύ υψηλό βαθμό συντήρησης με τις ομόλογες πρωτεΐνες NSCL1 του ανθρώπου και του ποντικού, οι οποίες αποτελούνται από 133 αμινοξέα. Στην περιοχή bHLH διαφέρουν μόνο κατά ένα αμινοξύ, έχοντας ποσοστό ομολογίας 98%. Kατά την εξέταση του προτύπου έκφρασης του γονιδίου cNscl1 διαπιστώσαμε ότι η έκφρασή του περιορίζεται αποκλειστικά σε νευρικές δομές τόσο του KNΣ όσο και του ΠNΣ, όπως συμβαίνει με τα ομόλογα γονίδια του ανθρώπου και του ποντικού. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε έκφρασή του σχεδόν σε όλες τις νευρικές δομές, όπως: το νευρικό σωλήνα, τα κρανιακά και τα αισθητικά γάγγλια, τον ιππόκαμπο, το διεγκέφαλο, το νωτιαίο μυελό, τον οπίσθιο εγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα. Με πειράματα in situ υβριδοποίησης παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του cNscl1 εντοπίζεται σε μεταμιτωτικούς νευρώνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού, που βρίσκονται στη φάση διαφοροποίησής τους, ενώ στην παρεγκεφαλίδα εντοπίζεται σε μιτωτικούς νευροβλάστες και μεταμιτωτικούς προμεταναστευτικούς νευρώνες της εξωτερικής κοκκώδους στοιβάδας. Σε στελέχη μυών με απώλεια δράσης του γονιδίου Hoxb1 διαπιστώσαμε ότι παύει η έκφρασή του mNscl1 στους προσωποκινητικούς νευρώνες, ενώ χρησιμοποιώντας μύες με απώλεια δράσης του γονιδίου mNscl1 διαπιστώσαμε υστέρηση στη φυσιολογική εξέλιξη της έκφρασης των γονιδίων Hoxb1, Hoxb2, Plzf και Engrailed-1 στον οπίσθιο εγκέφαλο, η οποία είναι πολύ πιθανόν να οφείλεται σε επιβράδυνση της διαδικασίας διαφοροποίησης των περιοχών αυτών του οπίσθιου εγκεφάλου. Η μελέτη μας αποκάλυψε νέες περιοχές έκφρασης του Nscl1. Διαπιστώσαμε ότι εκφράζεται στα ρομβομερή και στα όρια των ρομβομερών, καθώς και σε όρια τα οποία δημιουργούνται μετά από μικροχειρουργική επέμβαση η οποία επιφέρει γειτνίαση ενός περιττού και ενός άρτιου ρομβομερούς, ενώ δεν εκφράζεται στις περιπτώσεις γειτνίασης ρομβομερών με την ίδια αρτιότητα, οπότε δε δημιουργείται νέο όριο. Προκαλέσαμε υπερέκφραση και έκτοπη έκφραση του chick Nscl1 με τη χρήση του ρετροϊικού φορέα έκφρασης RCAS(BP)-cNSCL1, και παρατηρήσαμε ότι προκαλείται σμίκρυνση του ματιού και ανώμαλη ανάπτυξη του εγκεφάλου. Μελετήσαμε τη μεταγραφική ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα NSCL1 και βρήκαμε ότι ομοδιμερισμός του cNSCL1 που είναι σε σύντηξη με την περιοχή πρόσδεσης στο DNA του γονιδίου GAL4, επιφέρει καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου της λουσιφεράσης σε ένα πλασμίδιο αναφοράς. Απεναντίας, ετεροδιμερή του mNSCL1 με το ΜE1a προκαλούν ισχυρή μεταγραφική ενεργοποίηση προσδενόμενα σε Ε-boxes, τα οποία βρίσκονται ανοδικά του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. Η ενεργοποιητική ικανότητα του mNSCL1 πρέπει να εντοπίζεται σε μια πολύ βασική περιοχή (β’), η οποία βρίσκεται ανοδικά της bHLH περιοχής.