Έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

The progression of the cell cycle in eukaryotic cells is associated with the phase-specific expression of defined sets of genes, such as proto-oncogenes and tumour suppressor genes, while it is now widely accepted that transcription factors are also implicated. The family of E2F transcription factors and particularly E2F-1 participates to cell cycle progression. Numerous upstream stimulatory and inhibitory signals converge to the pRb/E2F pathway, which governs cellular future. The information concerning alterations of E2F-1 transcription factor in primary malignancies is very limited. Several in vitro studies report that E2F-1 can act either as an oncoprotein or as a tumour-suppressor protein. In view of this dichotomy in E2F-1 functions and its critical role in cell-cycle control, we examined in a panel of 87 non-small cell lung carcinomas (NSCLCs), previously analyzed for defects in the pRb-p52-MDM2 network (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al, Am J Pathol, 1998; 153: 1749-65 and Gorgoulis et al. Mol Med, 2000; 6: 208-237), the following: (i) the status of E2F-1 at the protein, mRNA, and DNA levels; (ii) its relationship with the kinetic parameters and genomic instability of the tumours; (iii) its association with the status of its transcriptional co-activator CBP (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al. J Pathol, in press); (iv) main cell-cycle regulatory and E2F-1 - interacting molecules pRb, p53 and MDM2; (v) its correlation with K-Ras protein at the transcriptional level; and (v) its impact on patients outcome. The protein levels of E2F-1 and its co-activator CBP were significantly higher in the tumour area than those observed in the corresponding normal epithelium (P<0.001). E2F-1 overexpression was associated with increased E2F-1 mRNA levels in 82% of the cases examined. The latter finding along with the low frequency of E2F-1 gene amplification observed (9%) (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al. J Pathol, in press), suggests that the main mechanism of E2F-1 protein overexpression in NSCLCs is deregulation at the transcriptional level. Mutational analysis revealed only one sample with a somatic mutation at codon 371 (Glu → Asp) and one carrying a polymorphism and at codon 393 (Gly → Ser). The most important observation was that carcinomas with increased E2F-1 positivity demonstrated a significant raise in their growth indexes (r=0.402, P=0.001) and were associated with adverse prognosis (P=0.033 by Cox regression analysis). The main determinant of the positive association with growth was the parallel increase between E2F-1 staining and proliferation (r=0.746, P<0.001), whereas apoptosis was not influenced by the status of E2F-1. Moreover, correlation with the status of the pRb-p53-MDM2 network showed that the cases with aberrant pRb expression displayed significantly higher E2F-1 indexes (P=0.033), while a similar association was noticed in the group of carcinomas with deregulated the p53-MDM2 feedback loop. Finally, there was a high tendency of association between the presence of K-Ras mutations and increased E2F-1 expression at mRNA levels (P<0.064). In conclusion, our results suggest that E2F-I overexpression may contribute to the development of NSCLCs by promoting proliferation and provide evidence that this role is further enhanced in a genetic background with deregulated the pRb-p53-MDM2 circuitry.

Ένας μεγάλος αριθμός επαγωγικών και ανασταλτικών σημάτων συγκλίνει στο μονοπάτι των πρωτεϊνών pRb-E2F-1, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στην πορεία του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα που αφορούν τις διαταραχές του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 στις πρωτογενείς κακοήθεις νεοπλασίες είναι περιορισμένα. Αρκετές in vitro μελέτες αναφέρουν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας E2F-1 μπορεί να δράσει είτε ως ογκοπρωτεΐνη είτε ως ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Λαμβάνοντας υπόψη αυτή τη διχογνωμία για τη λειτουργία του E2F-1 και το κρίσιμο ρόλο που διαδραματίζει στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, ασχοληθήκαμε με μία σειρά 87 δειγμάτων μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, που είχαν προηγουμένως μελετηθεί για γενετικές αλλοιώσεις στο δίκτυο των ρυθμιστικών πρωτεϊνών pRb-p52-MDM2 (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al. Am J Pathol, 1998; 153: 1749-65 and Gorgoulis et al. Mol Med, 2000; 6: 208-237), και εξετάσαμε τα ακόλουθα: α) τα επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 σε επίπεδο πρωτεΐνης, mRNA (επίπεδο μεταγραφής) και DNA (επίπεδο του γενετικού υλικού), β) τη σχέση του E2F-1 με τις κινητικές παραμέτρους και την γονιδιακή αστάθεια των όγκων, γ) τη σχέση του E2F-1 με τα επίπεδα του παράγοντα CBP, που λειτουργεί ως συνεργάτης του στη διαδικασία της μεταγραφής (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al, J Pathol, in press), καθώς και τη σχέση του με το δίκτυο των πρωτεϊνών pRb-p53-MDM2, που παίζουν ρυθμιστικό ρόλο κατά τη μετάβαση του κυττάρου από την G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου δ) τη συσχέτιση του E2F-1 με την ογκοπρωτεΐνη K-Ras και, ε) την επίδραση του E2F-1 στην εξέλιξη των ασθενών. Για τη μελέτη των πρωτεϊνικών επιπέδων του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας. Η μελέτη του E2F-1 σε επίπεδο μεταγραφής στηρίχθηκε σε μία ημι-ποσοτική αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης, σε συνδυασμό με την αντίστροφη μεταγραφή (RT-PCR). Στη συνέχεια διερευνήθηκε η πιθανότητα ύπαρξης μεταλλαγών με την αυτοματοποιημένη τεχνική ανίχνευσης της πρωτοταγούς αλληλουχίας του DNA κατά Sanger. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα τόσο του E2F-1, όσο και του CBP ήταν σημαντικά αυξημένα στις καρκινικές περιοχές σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό επιθήλιο (Ρ< 0.001). Η υπερέκφραση του E2F-1 συσχετίστηκε με τα αυξημένα επίπεδα του mRNA στο 82 % των περιπτώσεων. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη χαμηλή συχνότητα γονιδιακής ενίσχυσης (9%) που παρατηρήθηκε στα δείγματα σε προηγούμενη εργασία (Laboratory of Histology and Embryology: Gorgoulis et al, J Pathol, in press), υπονοεί ότι ο κυριότερος μηχανισμός υπερέκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 στο μη- μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα είναι η διαταραχή στο μεταγραφικό επίπεδο. Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση της πρωτοδιάταξης του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 αποκάλυψε μία μόνο σωματική μεταλλαγή στο κωδικόνιο 371 (αντικατάσταση του αμινοξέος γλουταμίνης από το αμινοξύ ασπαραγίνη), καθώς και έναν πολυμορφισμό στο κωδικόνιο 393 (αντικατάσταση του αμινοξέος γλυκίνη από ένα αμινοξύ σερίνης). Η πιο σημαντική όμως παρατήρηση της παρούσας εργασίας είναι ότι τα καρκινικά δείγματα με αυξημένα επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 εμφάνισαν σημαντική αύξηση των δείκτη ανάπτυξης (Ρ= 0.033 με Cox regression analysis). Η παραπάνω σχέση προκύπτει λόγω της παράλληλης αύξησης τόσο των πρωτεϊνικών επιπέδων του E2F-1, όσο και του δείκτη πολλαπλασιασμού (r= 0.746, Ρ< 0.001), ενώ η απόπτωση δε φαίνεται να επηρεάζεται από τα επίπεδα του E2F-1. Επιπλέον, η συσχέτιση με το ρυθμιστικό δίκτυο των πρωτεϊνών pRb-p53-MDM2, απεκάλυψε ότι διαταραγμένη έκφραση του pRb συνδέεται με σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του E2F-1 (Ρ= 0.033), ενώ παρόμοια συσχέτιση παρατηρήθηκε και με την ομάδα των καρκινωμάτων με διαταραγμένο τον παλίνδρομο αρνητικό μηχανισμό ανάδρασης των πρωτεϊνών p53-MDM2. Τέλος, αποκαλύφθηκε ότι υπάρχει μια τάση άμεσης συσχέτισης μεταξύ του E2F-1 και της ενεργοποιημένης με σημειακές μεταλλαγές ογκοπρωτεΐνης K-Ras στο επίπεδο μεταγραφής του πρώτου (Ρ< 0.064). Η συσχέτιση αυτή, που έχει ήδη αναφερθεί σε in vitro πειράματα κυτταρικών σειρών, προτείνει ένα εναλλακτικό τρόπο ενεργοποίησης του E2F-1 στα καρκινικά κύτταρα απευθείας από το K-Ras. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής προτείνουν ότι η υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1 πιθανόν να συμβάλλει στην ανάπτυξη του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα επάγοντας τον πολλαπλασιασμό. Φυσικά, η ογκογόνος δράση του E2F-1 είναι ιδιαίτερα έκδηλη σε κύτταρα με διαταραγμένο το δίκτυο των ρυθμιστικών πρωτεϊνών pRb-p53-MDM2.