Περίληψη
Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η αναγνώριση μορίων που συμμετέχουν στην ανοσοπαθολογία του συνδρόμου Sjögren. Αρχικά εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες μικρών σιελογόνων αδένων ασθενών με σύνδρομο Sjögren προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση διαφόρων αποπτωτικών πρωτεϊνών. Ο στόχος της προσέγγισης αυτής ήταν να διαλευκάνουμε τον μηχανισμό καταστροφής των επιθηλιακών κυττάρων στους μικρούς σιελογόνους αδένες των ασθενών. Τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν τις αποπτωτικές πρωτεΐνες Fas, Fas-Ligand και Bax και απέπιπταν όπως φάνηκε με την εφαρμογή της μεθόδου TUNEL. Εξάλλου, τα μονοπύρηνα διηθούντα κύτταρα εξέφραζαν Fas-Ligand, Bcl-2, διατορίνη και Θρυμματίνη-Β. Λόγω της έκφρασης του Bcl-2 τα μονοπύρηνα κύτταρα ήταν ανθεκτικά στην απόπτωση ενώ, προκαλούσαν τον αποπτωτικό θάνατο των επιθηλιακών κυττάρων μέσω της έκφρασης της διατορίνης και της Θρυμματίνης-Β. Τέλος τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν την αναγεννητική πρωτεΐνη pS2 σαν ένα πιθανό μηχανισμό άμυνας έναντι τω ...
Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η αναγνώριση μορίων που συμμετέχουν στην ανοσοπαθολογία του συνδρόμου Sjögren. Αρχικά εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες μικρών σιελογόνων αδένων ασθενών με σύνδρομο Sjögren προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση διαφόρων αποπτωτικών πρωτεϊνών. Ο στόχος της προσέγγισης αυτής ήταν να διαλευκάνουμε τον μηχανισμό καταστροφής των επιθηλιακών κυττάρων στους μικρούς σιελογόνους αδένες των ασθενών. Τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν τις αποπτωτικές πρωτεΐνες Fas, Fas-Ligand και Bax και απέπιπταν όπως φάνηκε με την εφαρμογή της μεθόδου TUNEL. Εξάλλου, τα μονοπύρηνα διηθούντα κύτταρα εξέφραζαν Fas-Ligand, Bcl-2, διατορίνη και Θρυμματίνη-Β. Λόγω της έκφρασης του Bcl-2 τα μονοπύρηνα κύτταρα ήταν ανθεκτικά στην απόπτωση ενώ, προκαλούσαν τον αποπτωτικό θάνατο των επιθηλιακών κυττάρων μέσω της έκφρασης της διατορίνης και της Θρυμματίνης-Β. Τέλος τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν την αναγεννητική πρωτεΐνη pS2 σαν ένα πιθανό μηχανισμό άμυνας έναντι των διαφόρων αποπτωτικών μηνυμάτων. Σε δεύτερο στάδιο, μελετήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών p53 και p21 σε βιοψίες μικρών σιελογόνων αδένων ασθενών με σύνδρομο Sjögren. Η μελέτη αυτή έγινε με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση κατά Western και ανέδειξε αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών αυτών στις βιοψίες των ασθενών σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Στη συνέχεια απομονώσαμε γενομικό DNA από ασθενείς με σύνδρομο Sjögren καθώς και από ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και in situ non-Hodgkin λέμφωμα, προκειμένου να πολλαπλασιάσουμε το γονίδιο p53 με PCR και να αναλύσουμε την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του. Το γονίδιο p53 στους ασθενείς με σύνδρομο Sjögren αποδείχτηκε ότι ήταν φυσικού τύπου, το οποίο υποδηλώνει την πιθανή ύπαρξη ενός παράγοντα βλάβης του DNA ο οποίος ενεργοποιεί τα γονίδια p53 και p21. Αντίθετα στους ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και in situ non-Hodgkin λέμφωμα αναδείχτηκαν δύο νέες μεταλλάξεις στο εξώνιο 5 του γονιδίου p53. Οι μεταλλάξεις ήταν σημειακές και προκαλούσαν αντικατάσταση αμινοξέων στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Είναι πιθανό, ότι εξαιτίας των μεταλλάξεων αυτών, το p53 χάνει την ικανότητά του να επιτηρεί την αρτιότητα του κυτταρικού κύκλου και έτσι τα κύτταρα χάνουν τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού τους και αναπτύσσεται λέμφωμα. Το επόμενο στάδιο της μελέτης μας ήταν να εφαρμόσουμε την τεχνική της διαφορικής έκθεσης σε δείγματα RNA από μικρούς σιελογόνους αδένες ασθενών και μαρτύρων έτσι ώστε να απομονώσουμε διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που παίζουν ρόλο στην παθοφυσιολογία του συνδρόμου Sjögren. Για την τεχνική αυτή χρησιμοποιήσαμε οκτώ διαφορετικά ζευγάρια τυχαίων ολιγονουκλεοτιδικών προωθητών. Απομονώθηκαν αρκετά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια τα οποία κλωνοποιήθηκαν και έγινε ανάλυση της αλληλουχίας τους και σύγκριση με την παγκόσμια τράπεζα γονιδίων μέσω του προγράμματος BLAST. Ένας κλώνος είχε 98% ομολογία με το γονίδιο CRISP-3. Η οικογένεια των γονιδίων CRISP αποτελείται από τρία μέλη (CRISP-1,2,3) τα οποία αρχικά απομονώθηκαν από αρσενικά ποντίκια, ενώ στους ανθρώπους εκφράζονται στους γεννητικούς και τους σιελογόνους αδένες των ανδρών. Στα ποντίκια η έκφραση του CRISP-3 εξαρτάται από τα ανδρογόνα. Αφού οι γυναίκες με σύνδρομο Sjögren έχουν έλλειψη ανδρογόνων και καθώς στην βιβλιογραφία δεν είναι γνωστός ο ρόλος ή η ρύθμιση του γονιδίου CRISP-3, υποθέσαμε ενεργοποίηση του γονιδίου από ανοσο-εξαρτώμενους μηχανισμούς. Για να αποδείξουμε την υπόθεση αυτή, πραγματοποιήσαμε RT-PCR σε δείγματα mRNA από 4 ασθενείς και 2 μάρτυρες και στη συνέχεια τα προϊόντα της αντίδρασης τα μετατρέψαμε in vitro σε RNA ιχνηθέτες για να πραγματοποιήσουμε in situ υβριδισμό. Το γονίδιο CRISP-3 εκφραζόταν και στους 4 ασθενείς ενώ η έκφραση του CRISP-3 mRNA ήταν εντοπισμένη στα διηθούντα μονοπύρηνα κύτταρα των ασθενών. Στη συνέχεια απομονώσαμε φυσιολογικά λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και τα ενεργοποιήσαμε με διάφορους πολυκλωνικούς ενεργοποιητές (PMA, ΡΗΑ, ιονομυκίνη, anti-CD3, anti-CD28, Σταυροσπορίνη) για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Το γονίδιο CRISP-3 εκφραζόταν μόνο στα ενεργοποιημένα με ΡΜΑ λεμφοκύτταρα μεταξύ μισής ώρας και έξι ωρών ενώ η Σταυροσπορίνη ανέστειλε αυτή την ενεργοποίηση. Χαρακτηρίσαμε έτσι το γονίδιο CRISP-3 σαν ένα νέο γονίδιο άμεσης ανταπόκρισης το οποίο είναι δυνατό να ενεργοποιηθεί μέσω των πρωτεϊνικών κινασών του κυττάρου. Τέλος, προκαταρκτικά πειράματα διαμόλυνσης με το CRISP-3 σε λέμφοβλαστοειδείς Β κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι αυξάνεται η έκφραση των CD25, CD20 και HLA-DR στην επιφάνεια των διαμολυσμένων κυττάρων. Είναι πιθανό ότι το γονίδιο CRISP-3 ενεργοποιείται κατά την πολυκλωνική ενεργοποίηση των διηθούντων κυττάρων στο σύνδρομο Sjögren και μετέχει στην διαδικασία της επικοινωνίας και απάντησης των λεμφοκυττάρων. Βέβαια είναι ακόμα νωρίς για να βγάλουμε τελικά συμπεράσματα για την δράση του CRISP-3 αλλά η συνέχιση των πειραμάτων θα μας οδηγήσει στην κατανόηση του ρόλου του CRISP-3 στην παθοφυσιολογία του συνδρόμου Sjögren.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The aim of these studies was to identify molecules involved in the pathogenesis of Sjogren’s syndrome (SS). Firstly, immunohistochemistry was performed in minor salivary gland (MSG) biopsies from patients with SS in order to identify the expression of different apoptosis-related proteins. The purpose of this approach was to clarify the mechanism of epithelial cell destruction in MSG biopsies of patients with SS. Epithelial cells of patients expressed the apoptotic proteins Fas, Fas-Ligand and Bax and were susceptible to apoptotic death as it was shown by the TUNEL assay. On the other hand, the mononuclear infiltrating cells expressed Fas-Ligand, Bcl-2, Perforin and Granzyme-B. Due to Bcl-2 expression the mononuclear infiltrating cells were resistant to apoptosis while they induced epithelial cell apoptosis through Perforin and Granzyme-B expression. Finally, epithelial cells of patients expressed the regenerative protein pS2 as a possible defensive mechanism against apoptotic destructi ...
The aim of these studies was to identify molecules involved in the pathogenesis of Sjogren’s syndrome (SS). Firstly, immunohistochemistry was performed in minor salivary gland (MSG) biopsies from patients with SS in order to identify the expression of different apoptosis-related proteins. The purpose of this approach was to clarify the mechanism of epithelial cell destruction in MSG biopsies of patients with SS. Epithelial cells of patients expressed the apoptotic proteins Fas, Fas-Ligand and Bax and were susceptible to apoptotic death as it was shown by the TUNEL assay. On the other hand, the mononuclear infiltrating cells expressed Fas-Ligand, Bcl-2, Perforin and Granzyme-B. Due to Bcl-2 expression the mononuclear infiltrating cells were resistant to apoptosis while they induced epithelial cell apoptosis through Perforin and Granzyme-B expression. Finally, epithelial cells of patients expressed the regenerative protein pS2 as a possible defensive mechanism against apoptotic destruction. Secondly, the expression of p53 and p21 in MSG biopsies of patients with SS was examined. These studies were performed by immunohistochemistry and Western blot and revealed increased expression of these proteins in MSGs of patients as compared to control individuals. The next step was to isolate genomic DNA from patients with SS as well as patients with SS and in situ non-Hodgkin’s lymphoma in order to perform PCR amplification of the p53 gene and sequence analysis. The p53 gene in patients with SS was wild type suggesting a possible existence of a DNA damaging agent in the exocrine glands of patients leading to p53 and p21 gene activation in order to facilitate DNA repair mechanisms. On the other hand, patients with SS and in situ non-Hodgkin’s lymphoma revealed two novel mutations on the DNA-binding domain of the p53 gene. These were point mutations and produced amino-acid substitutions. It is most likely that due to these mutations the p53 gene loses its ability to safeguard the cell cycle leading this way to uncontrolled cell proliferation and lymphoma development. The next step of our studies was to perform differential gene-display analysis so as to identify genes that participate in the pathogenesis of the disease. A MSG biopsy from a patient with primary SS and one from a control individual were used as the starting material. Total RNA was isolated from these samples to perform a differential display protocol with eight different random pairs of oligonucleotide primers. Severaldifferentially expressed genes were isolated, reamplified and cloned for sequence analysis. Sequences were compared with the Gene bank sequence-database. One clone had 98% homology with the human CRISP-3 gene. The CRISP gene family consists of three members (CRISP-1, 2, 3); they were originally isolated from male mice while in humans they are expressed in the male genital tract and the male salivary glands. The expression of the CRISP-3 gene is under the restricted control of androgens. Since women with SS have an androgen deficiency while there was still no evidence about the function of the CRISP-3 gene; an activation of the gene through immune-mediated activation pathways was suspected. In order to prove this hypothesis we firstly performed a RT-PCR in RNA samples from four patients with SS and two controls and found that only SS patients expressed the CRISP-3 gene. Secondly, in vitro transcription was employed to create RNA probes for in situ hybridization revealing that the CRISP-3 transcripts were expressed mainly by the mononuclear cells infiltrating the MSGs of patients with SS. The next step was to isolate normal peripheral blood lymphocytes (PBLs) and activate them in culture in order to identify CRISP-3 gene expression. Several PBL activators were used (PMA, PHA, ionomycin, a-CD3, a-CD28) in different time-periods (t: 0, t: 6, t: 12, t: 24, t: 48). Total RNA was isolated from these cells to perform RT-PCR that revealed that CRISP-3 gene was expressed only in PMA-treated cells after 6 hours in culture. Trying to identify the signaling pathway leading to CRISP-3 gene activation PBLs were activated with PMA in different time periods (t: 30min, t: 1h, t: 3hrs, t: 6hrs) while other PBLs were treated with PMA and Staurosporine to inhibit the PKC signaling. These experiments revealed that the CRISP-3 gene is an early-transcribed gene (between 30min and 6 hrs.) while PKC mediates this expression since the addition of Staurosporine downregulated CRISP-3 gene activation. Finally, the coding region of the CRISP-3 gene was introduced into the pIRES2-EGFP vector and used to transfect BJAB B-cells. Transfected cells lost the typical round shape of B cells and became more elongated like B cells at the terminal phase of their differentiation. Flow cytometric analysis showed that CRISP-3 is capable of inducing the expression of HLA-DR, CD20 and CD25 on the surface of transfected cells. These results implicated CRISP-3 in B-cell activation and differentiation pathways. In MSGs of patients with SS the CRISP-3 gene may be activated in the concept of the polyclonal activation of infiltrating B cells. As an early-response gene it may participate in B cell activation perpetuating the autoimmune B cell reaction in the lesion. These speculations are still under experimentation.
περισσότερα