Μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα E2F1 στα οστεοσαρκώματα

Abstract

Grade, τύπος οστεοσαρκώματος, εντόπιση και νέκρωση όγκου % μετά την θεραπευτική χημειοθεραπεία. Η συσχέτιση της νέκρωσης (NecrChem) του όγκου με την θεραπευτική χημειοθεραπεία έδειξε πως υπάρχει σχέση μεταξύ βαθμού κακοήθειας-Grade και θεραπευτικής χημειοθεραπείας και μάλιστα υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Grade 1 και 3. Επίσης διαπιστώθηκε μια μείωση της νέκρωσης σε όγκους μεγαλύτερου Grade (Grade 2,3) .Methods: 61 preparations of osteosarcoma tissue were used. Out of these preparations only 57 were evaluated. The samples were fixed in formole and were placed in parafine cubes. In this study we used immunohistopathologic methods and specifically the ABC method (avidin - biotin - superoxidase) with diaminobenzidin (DAB) being the chromogen for the tracing of special cell antigens. For the evaluation of the kinetic parameters we used in situ techniques. The multiplication index of the cells was evaluated with immunohistochemical localization of Ki67 antigen. The apoptosis index was evaluated with the TUNEL technique, by marking 3 free tail of DNA with the use of caspase 3. Furthermore, the expression of the oncosuppressive protein p53 was studied. Finally, all the possible interactions were studied by using a variety of statistical tests. Results: the expression of E2F1 was found to be positive in 65.61% of the total samples with the values ranging from 20% to 90%. The percent of the positive distribution of the stain for caspase 3 ranged from 0.1% to 10% with a mean of 2.125%, while the percent distribution of the positive stain for the Ki67 ranged from 1% to 90% with a mean of 28.82%. As far as the immunohistochemical stain of p53 is concerned, we noted that it was negative in 17 cases (27.86%), positive in 40 cases (65.57%) while in 4 cases it was non notable, considerable, measurable (6,57%).A very important finding of this study is the statistically significant negative correlation between E2F1 and Ki67 (Kendall method p= 0.038 but the correlation is relative small with tau=0.19), a correlation that is verified with the parametric statistical technique of Pearson coefficient of Correlation (r= -0,276 p=0,037).

Ο παράγοντας E2F1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που δρα κατά την μετάβαση του κυττάρου από την φάση Gl στην φάση S του κύκλου. Η δράση του ελέγχεται από το ογκοκατασταλτικό γονίδιο του ρετινοβλαστώματος (pRB) και η σύνδεση του E2F1 με την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος οδηγεί σε απενεργοποίησή του ενώ η απελευθέρωσή του από αυτήν,στην Gl φάση, οδηγεί τα κύτταρα στην είσοδό τους στην φάση S.Ο ρόλος του E2F1 σύμφωνα με μελέτες ανάλογα με την νεοπλασία είναι διπλός και φαίνεται να δρα άλλοτε ως ογκογονίδιο και άλλοτε ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο προωθώντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την απόπτωση των κυττάρων.ΣΚΟΠΟΣ : ήταν η μελέτη της έκφρασης του E2F1 στα οστεοσαρκώματα και η διερεύνηση της πιθανής του σχέσης με κινητικές παραμέτρους της κυτταρικής αύξησης και της απόπτωσης. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η έκφραση του E2F1, η έκφραση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης ρ53, η έκφραση της κασπάσης 3 (casp 3) ως δείκτη απόπτωσης (κυτταρικός θάνατος) και η έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού ΚΪ67. Ακολούθησαν συσχετίσεις μεταξύ αυτών των παραμέτρων και συσχετίσεις με κλινικοπαθολογικά στοιχεία.ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ : Χρησιμοποιήθηκαν 61 παρασκευάσματα ιστών οστεοσαρκωμάτων από τα οποία αξιολογήθηκαν τα 57. Τα δείγματα ήταν μονιμοποιημένα σε φορμόλη και τοποθετημένα σε κύβους παραφίνης.Στην μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι και συγκεκριμένα η μέθοδος ABC (αβιδίνης - βιοτίνης - υπεροξειδάσης) με χρωμογόνο τη διαμινοβενζιδίνη (DAB) για την ανίχνευση ειδικών κυτταρικών αντιγόνων. Για την εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων χρησημοποιήθηκαν in situ τεχνικές. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημική εντόπιση του αντιγόνου KÎ67 και ο δείκτης απόπτωσης με την τεχνική TUNEL, με την σήμανση ελευθέρων 3 άκρων του DNA με την χρήση της κασπάσης 3. Επίσης μελετήθηκε η έκφραση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης ρ53. Τέλος, με μια σειρά στατιστικών δοκιμασιών αξιολογ θηκαν οι μεταξύ τους πιθανές συσχετίσεις.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ : Η έκφραση του E2F1 βρέθηκε θετική σε ποσοστό 65.61% του συνόλου των δειγμάτων με διακύμανση τιμών από 20% έως 90%. Η επί τοις εκατό θετική κατανομή της χρώσης για την KÎ67 κυμάνθηκε από 1% έως 90% με μέσο όρο 28,82% ενώ η επί τοις εκατό θετική κατανομή της χρώσης για την κασπάση 3 κυμάνθηκε από 0,1% έως 10% με μέσο όρο 2,125%. Όσον αφορά την ανοσοϊστοχημική χρώση του ρ53 διαπιστώθηκε ότι ήταν σε 17 περιπτώσεις αρνητικό σήμα (27,86%), σε 40 θετικό (65,57%) ενώ σε 4 περιπτώσεις ήταν μη αξιολογήσιμο (6,57%).Σημαντικό εύρημα είναι η στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ E2F1 και KÌ67 (μέθοδος Kendall ρ=0.038 με σχετικά μικρή συσχέτιση tau=-0.19), σχέση που επιβεβαιώνεται και μετά την εφαρμογή της παραμετρικής δοκιμασίας κατά Pearson ( r= -0,276 ρ=0,037). Το παραπάνω εύρημα δηλώνει ότι αυξημένη έκφραση του E2F1 σχετίζεται με χαμηλή έκφραση του KÌ67 και επομένως με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού γεγονός που αποδίδει στο E2F1 ρόλο ογκοκατασταλτικού γονιδίου στο οστεοσάρκωμα.Άλλο αξιόλογο εύρημα με στατιστικά σημαντική θετική σχέση ήταν η σχέση μεταξύ του KÎ67 και της Caspase 3 (μέθοδος Kendall tau=-0,3284356, ρ=0,0008706). Εύρημα που δηλώνει ότι στα οστεοσαρκώματα ο υψηλός ρυθμός πολλαπλασιασμού συμπίπτει με υψηλό ρυθμό απόπτωσης. Η συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας μεταλλάξεων του ρ53 και του E2F1 ή του ρυθμού αύξησης KÎ67 δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντικά ευρήματα (ΐ=0,9355, ρ=0,3567).Δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ E2F1 ή KÎ67 και κλινικοπαθολογικών δεδομένων όπως ηλικία, Grade, τύπος οστεοσαρκώματος, εντόπιση και νέκρωση όγκου % μετά την θεραπευτική χημειοθεραπεία. Η συσχέτιση της νέκρωσης (NecrChem) του όγκου με την θεραπευτική χημειοθεραπεία έδειξε πως υπάρχει σχέση μεταξύ βαθμού κακοήθειας-Grade και θεραπευτικής χημειοθεραπείας και μάλιστα υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Grade 1 και 3. Επίσης διαπιστώθηκε μια μείωση της νέκρωσης σε όγκους μεγαλύτερου Grade (Grade 2,3) .