Παράγοντες που καθορίζουν την οργανογένεση in vitro σε τρία υποκείμενα εσπεριδοειδών

Abstract

Citrus culture has a great economical significance for many countries all over the world including Greece. The choice of the appropriate rootstock ensures high productivity and excellent fruit quality. The aim of this dissertation was to study micropropagation of three citrus rootstocks namely Trifoliate orange (Τ.Ο.), Sour orange (S.Ο.) and Citrumelo (Ct.). In an effort to separate zygotic from nucellar plant material different DNA isoforms were observed in cotyledons from Τ.Ο. and S.Ο. seeds. In zygotic plant material, smaller number of isoforms was observed. Concerning endogenous protein phosphorylation during seed germination, differences were recorded in the number and intensity of peptide bands of NDP kinases. To study how the culture medium and growth regulators affect organogenesis, shoot tips explants were cultured in the MS substrate containing several concentrations of various regulators agar and sucrose and various pH levels. The data indicate that only certain parameters of three citrus rootstocks were influenced positively by several treatments. The study of organogenesis from epicotyl explants, mature shoot tips explants, mature leaves and root tip explants had a positive effect on certain cases. Green globular bodies and shoots were developed from root tip explants of Τ.Ο. and Ct. as a response to addition in the substrate of different growth regulators. From the anatomical study of the root tip explants and the green globular bodies, variations in structure and anatomy of roots were observed (secondary root growth was recorded in comparison to control). Moreover this study indicates that the green globular bodies containing parenchymatic cells multiply by mitotic division. The study of DNase activity of green globular bodies indicated that exogenous application of growth regulators increased DNase activity. Also, the activity of NDP kinases was influenced by the increase of BA concentration alone and in combination with other growth regulators. As a result, different peptide bands of NDP kinases were observed. Overall, the purpose of this dissertation was the separation of zygotic from nucellar seedlings in order to take the desirable plant material, and the answer of biochemical and anatomical questions about organogenesis of three commercial citrus rootstocks. Furthermore, the final aim of this study was the development of an efficient protocol for micropropagation of these citrus rootstocks. The determination of optimal conditions for their mass propagation is very important, as they have desirable characteristics and they are used widely in agriculture.

Τα εσπεριδοειδή αποτελούν μια καλλιέργεια μεγάλης οικονομικής σημασίας τόσο για την ελληνική όσο και για την παγκόσμια οικονομία. Τα κατάλληλα υποκείμενα είναι η πρώτη από μια σειρά επίλογων που θα διασφαλίσουν μια ποιοτική και υψηλή παράγωγη. Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση του μικροπολλαπλασιασμού τριών υποκειμένων εσπεριδοειδών, της Τρίφυλλης πορτοκαλιάς, της Νεραντζιάς και του Citrumelo. Για την επίτευξη του παραπάνω σκοπού εξετάστηκε αρχικά η ενζυμική δραστηριότητα των νουκλεολυτικών ένζυμων και των κινασών των διφωσφονουκλεοζιτών σε σπέρματα με σκοπό το διαχωρισμό εγγενών και απομικτικών αποροφύτων. Στην προσπάθεια χαρακτηρισμού του φυτικού υλικού ως εγγενούς ή απομικτικού παρατηρήθηκαν λιγότερες ισομορφές DNασών σε σχέση με απομικτικά σπορόφυτα σε κοτυληδόνες από σπέρματα Τρίφυλλης πορτοκαλιάς και Νεραντζιάς. Όσο αφορά την ενδογενή πρωτεϊνική φωσφορυλίωση διαπιστώθηκαν διαφορές στον αριθμό και την ένταση των πεπτιδικών ζωνών των NDP κινασών. Για να μελετηθεί πως επιδρούν οι παράγοντες του υποστρώματος και οι ρυθμιστές αύξησης στην οργανογένεση, βλαστικές κορυφές εγκαταστάθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα MS που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις ρυθμιστών άγαρ σακχαρόζης και τιμές pH. Και στα τρία υποκείμενα μόνο ορισμένες παράμετροι επηρεάστηκαν θετικά από τις διαφορετικές μεταχειρίσεις. Μελετήθηκε επιπλέον η οργανογένεση από έκφυτα επικοτύλης, ώριμους βλαστούς, ώριμα φύλλα και ρίζες με θετικά αποτελέσματα σε κάποιες μεταχειρίσεις. Συγκεκριμένα η επίδραση ρυθμιστών αύξησης προκάλεσε το σχηματισμό πράσινων σφαιρικών σωματίων και βλαστογένεση σε ριζικά έκφυτα Τρίφυλλης πορτοκαλιάς και Citrumelo. Πραγματοποιήθηκε επιπλέον ανατομική μελέτη στα ριζικά έκφυτα των τριών υποκείμενων για να προσδιοριστεί η επίδραση διαφορετικών μεταχειρίσεων στην οργανογένεση. Παρατηρήθηκαν διαφορές στην ανατομία της ρίζας (δευτερογενής αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες). Επιπλέον διαπιστώθηκε πως τα σφαιρικά σωμάτια αποτελούνται από παρεγχυματικά κύτταρα και πολλαπλασιάζονται μεταξύ τους με μιτωτική διαίρεση. Επίσης εξετάστηκε η ενζυμική δραστηριότητα στα σφαιρικά σωμάτια και προέκυψε πως οι ρυθμιστές αύξησης επηρέασαν τον αριθμό ισόμορφων των DNασών και τη δράση των NDP κινασών με αποτέλεσμα το σχηματισμό διαφορετικών πεπτιδικών ζωνών και διαφορετικής έντασης. Απώτερος στόχος της διατριβής ήταν η απάντηση βιοχημικών και ανατομικών ερωτημάτων καθώς και η διατύπωση ενός ενδεδειγμένου πρωτοκόλλου εργασίας για το μικροπολλαπλασιασμό των τριών υποκειμένων, που θα έχει πρακτική άξια στον εμπορικό πολλαπλασιασμό τους. Ο προσδιορισμός των κατάλληλων συνθηκών για τη μαζική παράγωγη τους αποκτά σημαντική άξια, καθώς εμφανίζουν επιθυμητά χαρακτηριστικά και χρησιμοποιούνται ευρέως.