Μελέτη της μετανάστευσης και διαφοροποίησης των νευρικών στελεχιαίων κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος μετά από μεταμόσχευση τους στον εγκέφαλο μυών με πειραματική αλλεργική εγκεφαλομυελίτιδα

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is the most commonly diagnosed neurological disease in young adults. Demyelination, axonal degeneration, neuronal dysfunction and apoptosis are key features in MS pathology and current evidence suggests that remyelination to some extent also occurs spontaneously. The current treatment of MS relies on immunologic manipulation and deals substantially with the inflammatory and immunologic aspects. However, it is becoming clear that repair should be considered as a goal for treatment. Although there are now therapies that can prevent exacerbations, we still lack knowledge about how to promote effective remyelination. Adult brain contains adult Neural Stem Cells (NSCs) in regional pools and progenitors scattered throughout the Central Nervous System (CNS), and these cells may be able to engage in some degree of endogenous repair. However, the size of the lesion may overcome the capacity for endogenous precursor cells to repair the damage. On the other hand, precursor cells could be the targets of the pathological process with adverse repercussions on the innate ability of the CNS to self-repair. In addition if the aetiology for disease progression resides in the host genome, then endogenous progenitors will also be flawed and will not represent a good source for repair. Hence, transplanted exogenous remyelinating cells from a nondiseased source may be required. Abundant sources of myelinating cells have been identified and various different strategies of transplantation the last decades have been proposed. Therefore remarkable progress has been achieved on that field. Because NSCs are able to give rise to different classes of neural cells e.g. neurons, astrocytes and oligodendrocytes, they have the potential to replace and/or repair cells lost in neurodegenerative diseases, such as MS. Such cells may be additionally genetically modified ex vivo prior to transplantation to optimize remyelination and support axonal repair. In the present doctoral thesis we studied the behaviour of transplanted NSCs of CNS in the inflammatory and demyelinated environment of chronic Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE), the most reliable experimental model of MS up today. Self-renewal and multipotentiality are the hallmark definitions of NSCs. The NSCs can be cultured and expanded at large number and 180 subsequently used for transplantation. With a set of transplantation experiments we studied the environmental regulation of grafted NSCs survival and differentiation and we made an effort to address the potential therapeutic applications of these cells. The induction of chronic EAE was held in five to six-week-old C57Bl/6 female mice, immunized subcutaneously at the base of the tail with an emulsion consisting of purified MOG 35-55 diluted in a solution containing complete Freund’s adjuvant and PBS. Mice were also injected i.p. with Pertussis toxin diluted in PBS on the day of immunization. At the 2nd day post induction the animals were injected again with Pertussis toxin but this time using half of the initial dose. At day 7 post induction a booster of MOG was performed.

Η ΠΣ θεωρείται η συχνότερα διαγνωσμένη νευρολογική νόσος σε νεαρούς ενήλικες. Αποτελεί μια χρόνια φλεγμονώδη νευροεκφυλιστική πάθηση που χαρακτηρίζεται από απομυελίνωση, νευραξονική εκφύλιση και νευρολογική δυσλειτουργία, ενώ ως ένα βαθμό συμβαίνει ενδογενής επαναμυελίνωση. Αν και οι μέχρι σήμερα θεραπείες στοχεύουν στην ανοσοτροποποίηση και μπορούν να αποτρέψουν τις εξάρσεις της νόσου, στερούμαστε ακόμα τη γνώση για το πώς να προωθήσουμε την αποτελεσματική επαναμυελίνωση. Ο ενήλικος εγκέφαλος περιέχει ΝΣΚ και πρόδρομα/προγονικά κύτταρα διασκορπισμένα σε όλο το ΚΝΣ και αυτά τα κύτταρα είναι σε θέση να συμμετέχουν σε κάποιο βαθμό στην αποκατάσταση. Εντούτοις, το μέγεθος της αλλοίωσης είναι τέτοιο που υπερνικά την ικανότητα των ενδογενών κυττάρων να αποκαταστήσουν τη βλάβη. Αφ' ετέρου, τα κύτταρα αυτά, μπορεί επίσης να είναι στόχοι της παθολογικής διαδικασίας ή να έχουν γενετική προδιάθεση δυσλειτουργίας με εμφανή δυσμενή αντίκτυπο στην έμφυτη δυνατότητα του ΚΝΣ για αυτό-αποκατάσταση. Επομένως, η μεταμόσχευση εξωγενών κυττάρων, σαν μια εναλλακτική πηγή, μπορεί να αποτελεί την λύση της αποτελεσματικής επαναμυελίνωσης. Οι θεραπείες με χρήση κυτταρικών μοσχευμάτων έχει αποτελέσει ένα πολύ ενεργό ερευνητικό τομέα τις τελευταίες δεκαετίες και έχει επιτευχθεί αξιοσημείωτη πρόοδος. Άφθονες πηγές μυελινωτικών κυττάρων έχουν ταυτοποιηθεί και έχουν προταθεί ποικίλες διαφορετικές στρατηγικές μεταμόσχευσης. Τα ΝΣΚ εξαιτίας της πολυδυναμίας τους, δηλαδή της ικανότητάς τους να δίνουν γένεση και στους τρεις κυτταρικούς τύπους του ΚΝΣ, έχουν την ικανότητα της αντικατάστασης των προσβλημένων κυττάρων σε νευροεκφυλιστικές νόσους όπως η ΠΣ. Αυτά τα κύτταρα μάλιστα μπορούν να είναι επιπρόσθετα γενετικά τροποποιημένα ex vivo πριν από την μεταμόσχευση, για να βελτιστοποιήσουν την επαναμυελίνωση και να υποστηρίξουν την νευραξονική αποκατάσταση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η συμπεριφορά των ΝΣΚ του ΚΝΣ στο φλεγμονώδες αρχικά και απομυελινωτικό μετέπειτα περιβάλλον της χρόνιας ΠΑΕ, του πιο αξιόπιστου μέχρι σήμερα πειραματικού μοντέλου που ομοιάζει με την ΠΣ. Τα ΝΣΚ χάρις στην ικανότητά τους να παρουσιάζουν μεγάλη ικανότητα ανανέωσης in vitro, με αποτέλεσμα να επιτρέπουν την παραγωγή μεγάλων κυτταρικών πληθυσμών, αντιπροσωπεύουν μια ανανεώσιμη πηγή κυττάρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαδικασίες μεταμόσχευσης. Η μελέτη της συμπεριφοράς αυτής επιτεύχθηκε με σειρά πειραμάτων που αφορούν στην καλλιέργεια των ΝΣΚ πειραματοζώων τα οποία εκφράζουν στα κύτταρά τους την GFP και εν συνεχεία μεταμόσχευση τους στις πλάγιες κοιλίες θηλυκών C57Bl/6 μυών ηλικίας 6-7 εβδομάδων, στους οποίους είχε προκληθεί προηγουμένως η χρόνια ΠΑΕ με MOG 35-55. Η πρόκληση της ΠΑΕ γινόταν την ίδια μέρα με την απομόνωση ΝΣΚ από τα εγκεφαλικά ημισφαίρια νεογέννητων μυών για να ακολουθήσει η καλλιέργειά τους.