Η επίδραση της χρόνιας αύξησης της ενδοκοιλιακής πίεσης στο διάφραγμα: πειραματική εργασία σε κουνέλια

Abstract

Introduction: The diaphragm is the main respiratory muscle of the man. Its muscular fibers are divided, mainly, in three types (type I, type IIA and type IIB/X). All types of muscular fibers are in dynamic balance and their ratio varies in time. The ratio of the fiber types in the muscle characterizes its contractile properties and is a function of various conditions. Up to date several studies concerning the action of the acute abdominal pressure on the organs and systems, as well as the diaphragm, have been done. However, there is no study available concerning the action of the chronically elevated intra-abdominal pressure (IAP) on the diaphragm. This fact urged us to plan and perform the present experimental study, the aim of which is to identify the morphologic, enzymatic and biochemical changes of the diaphragm due to the chronically elevated IAP. This could be the first step in confronting pathologic conditions related to the chronically elevated IAP. Material and Methods: Fourty five male New Zealand rabbits, weighting 3-3.5kg, were divided into three equal groups. Group A was the control group including 15 rabbits with empty intraabdominal balloons, group B was the study group including 15 rabbits with the intraabdominal balloon fulled with saline solution and with IAP elevated to 16 cmH₂O for 8 weeks and group C including 15 rabbits with intraabdominal balloons fulled with plumb weighting the same as the saline solution in group B. The balloon was surgically inserted into the peritoneal cavity of all animals under direct vision and general anesthesia. The animals were then transferred to the feeding area where they remained for 8 weeks. The IAP was verified every three days by direct measurement. The cuniculturer didn’t know the group in which each animal was included. The animals were fed ad libidum. After eight weeks, the animals were transferred to the place of sacrification where they remained for a week, in order to reduce their stress. The rabbits were then anesthetized, sacrificed and the whole diaphragm was quickly removed and immediately placed in an aerated and cooled Krebs solution. The costal diaphragm was dissected and samples were taken for histological, enzymatic and biochemical analysis. The left hemidiaphragm was fold, transversely cut, and put into ‘‘tissue glue’’ (Tissue-Tek, Elkhart, IN, USA) on a cork with the longitudinal axis of the fibers oriented perpendicularly to the cork. Each preparation was immediately immersed in isopentane cooled into liquid N2. Serial cross-sections (10 μm thickness) parallel to the cork were cut with a cryostat at -20°C. Two sections of each muscle were stained with Hematoxylin and Eosin for further histological evaluation. The other serial sections were stained for myofibrillar adenosine triphosphatase (ATPase) after a preincubation at pH 4.3, 4.6 and 9.4. The right hemidiaphragm was sent for biochemical analysis including quantification of: (a) the preoxidative-antioxidative balance, (b) lipid peroxidation, (c) superoxide dismutase activity, (d) glutathione reductase activity, (e) glutathione peroxidase activity, (f) total glutathione and (g) proteine carbonylation. All parameters were expressed as mean value ± standard deviation. The muscle fibers ratios were expressed as percentages. Control of the normal distribution was done with Kolmogorov-Smirnov test, while for the detection of differences Kruskall-Wallis and Mann-Whitney U tests were performed. The level of statistical significance was set at p<0.05. Results: Macroscopically, the diaphragm of the animals in all groups was without pathological findings. Atrophy or hypertrophy of the muscular fibers was not observed, while in Hematoxyline & Eosine the muscular fibers were within normal range for all animals. The enzymatic analysis of the fibers demonstrated that concerning type I fibers there was statistical significant differences between group A and B, while between groups A and C, and B and C this was significant with p=0.027 and p=0.034 respectively. Concerning the fibers ΙΙΑ ratios statistically significant decrease was observed between A and B (p=0.044) and increase between groups A and C (p=0.001) and B and C (p<0.001). Finally, the type ΙΙΒ/X fiber ratio was statistically significant increased between groups B and A (p=0.05) and C (p=0.001). Concerning the biochemical tests no statistical differences were observed for total gloutathione and superoxide dismoutase between the three groups. The lipid peroxidation was elevated in group B in comparison to group A and C (p=0.005 and p=0.0098 respectively). Concerning the antioxidative defence of the diaphragm, the glutathione perioxidase activity was elevated in animals of both group B and C in comparison to controls (p=0.021 and p<0.001 respectively). The value of glutathione reductase was statistically elevated in animals of group B in comparison to those of group A (p=0.004), while no statistically important differences were observed between group C and the other groups. The protein carbonylation presented statistically important difference between group B and the other two groups (p=0.029 and 0.033 for groups A and C respectively). Finally, concerning the preoxidative-antioxidative balance it was elevated for group B (p=0.006 for group A and p=0.267 for group C). Conclusions: The chronically increased IAP induces alterations to the muscular fibers of the diaphragm. These changes were identified by enzymatic and biochemical analysis of the muscle. The observed changes were different between the group with chronically elevated IAP and the group with weight charge. This means that the diaphragm is subject to adaptations related to the condition under which it functions. With respect of the model application in clinical conditions we may conclude that the chronically increased IAP induces changes in the enzymatic and biochemical pathways of the diaphragm resulting in adaptation of the muscle to the conditions of respiratory load.

Εισαγωγή: Το διάφραγμα αποτελεί τον κύριο αναπνευστικό μυ του ανθρώπου. Στις μυϊκές δεσμίδες του οι μυϊκές ίνες βρίσκονται ανά πάσα στιγμή σε δυναμική ισορροπία μεταξύ τους και η αναλογία τους μπορεί να μεταβάλλεται στο χρόνο, επηρεαζόμενη από πολλούς παράγοντες. Μέχρι σήμερα έχουν γίνει πολλές μελέτες που αφορούν στην επίδραση της οξείας αύξησης της ενδοκοιλιακής πίεσης (ΕΠ) στα όργανα και συστήματα καθώς επίσης και στο διάφραγμα, ενώ ουδεμία μελέτη υπάρχει στη διεθνή βιβλιογραφία που να αφορά στην επίδραση της χρόνιας αύξησης της ΕΠ στο διάφραγμα. Το γεγονός αυτό μας ώθησε στο σχεδιασμό και εκτέλεση της παρούσας πειραματικής εργασίας, σκοπός της οποίας είναι η αναγνώριση μορφολογικών, ενζυματικών και βιοχημικών μεταβολών του διαφράγματος που οφείλονται στη χρόνια αύξηση της ΕΠ και αυτό να αποτελέσει βήμα στην αντιμετώπιση παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται με αυτή. Υλικό και Μέθοδοι: Για το σκοπό της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 45 αρσενικά ενήλικα κουνέλια του είδους Oryctolagus cuniculus, της ράτσας New Zealand, βάρους 3-3.5 kg το κάθε ένα. Τα πειραματόζωα διαιρέθηκαν σε τρείς ομάδες: Η ομάδα Α, η οποία αποτέλεσε την ομάδα ελέγχου, περιέλαβε 15 πειραματόζωα στα οποία τοποθετήθηκαν ενδοκοιλιακοί αεροθάλαμοι τελείως κενοί. Την ομάδα Β, ομάδα μελέτης, αποτέλεσαν 15 πειραματόζωα στα οποία τοποθετήθηκαν ενδοκοιλιακοί αεροθάλαμοι, οι οποίοι πληρώθηκαν με φυσιολογικό ορό δημιουργώντας σταθερή ΕΠ 16 cmH₂O για 8 εβδομάδες. Η ομάδα Γ περιέλαβε 15 πειραματόζωα στους ενδοκοιλιακούς αεροθαλάμους των οποίων τοποθετήθηκαν τεμάχια μολύβδου βάρους ίσου με το μέσο βάρος του ορού πλήρωσης των πειραματοζώων της ομάδας Β. Μετά την πλήρη ανάνηψη του ζώου από την αναισθησία η ΕΠ επαναπροσδιοριζόταν, προσαρμοζόταν και σταθεροποιούνταν στα 16cmH₂O. Κατόπιν τα πειραματόζωα μεταφέρονταν στον χώρο εκτροφής, όπου και παρέμειναν για 8 εβδομάδες με κανονική ad libidum διατροφή, χωρίς ο κονικλοτρόφος να γνωρίζει σε ποια ομάδα ανήκαν, ενώ μέτρηση και επαναρρύθμιση της ΕΠ γινόταν κάθε 3 μέρες. Μετά την παρέλευση των 8 εβδομάδων τα κουνέλια μεταφέρονταν στον χώρο θυσίας όπου και παρέμεναν για μία ακόμα εβδομάδα με σκοπό την προσαρμογή και την ελαχιστοποίηση του στρες και υπό γενική αναισθησία θυσιάζονταν. Στη συνέχεια, με μέση ξιφo-ηβική τομή διανοίγονταν η περιτοναϊκή κοιλότητα, εξεταζόταν μακροσκοπικά το διάφραγμα, αναγνωρίζονταν ο αεροθάλαμος, ελέγχονταν για τυχόν διαφυγή περιεχομένου του και συμφύσεις ή άλλες παθολογικές διεργασίες με τα ενδοκοιλιακά σπλάχνα. Κατόπιν παρασκευαζόταν και αφαιρούνταν ολόκληρο το διάφραγμα. Το αριστερό ημιδιάφραγμα αποχωρίζονταν και αποστέλλονταν για ιστοπαθολογική και ενζυματική εξέταση, όπου δύο τομές από κάθε δείγμα χρωματίζονταν με Αιματοξυλίνη και Εωσίνη (Η&Ε), ενώ οι υπόλοιπες τομές χρωματίζονταν με mATPάση σε τρία διαφορετικά pH (4.3, 4.6 και 9.4) για ενζυματική μελέτη. Το δεξιό ημιδιάφραγμα αποστέλλονταν για βιοχημική ανάλυση που περιλάμβανε μέτρηση (α) του ισοζύγιου προξειδωτικών-αντιοξειδωτικών, (β) της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, (γ) της δραστηριότητας της υπεροξειδικής δισμουτάσης, (δ) της δραστηριότητας της αναγωγάση της γλουταθειόνης, (ε) της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης, (στ) της ολικής γλουταθειόνης και (ζ) της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών. Όλες οι παράμετροι που μετρήθηκαν εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Ο τύπος των μυϊκών ινών εκφράστηκε ως εκατοστιαία αναλογία επί του συνόλου των μυϊκών ινών. Έγινε έλεγχος κανονικότητας της κατανομής με τη μέθοδο Kolmogorov-Smirnov για κάθε παράμετρο. Η ανίχνευση διαφορών μεταξύ των τριών ομάδων έγινε με τη δοκιμασία Kruskall-Wallis, η οποία ακολουθήθηκε από την εφαρμογή κατά ζεύγη της δοκιμασίας Mann-Whitney U test. Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε η τιμή p<0.05. Αποτελέσματα: Μακροσκοπικά, το διάφραγμα των πειραματοζώων και των τριών ομάδων, ήταν χωρίς παθολογικά ευρήματα. Εμφανής ατροφία ή υπερτροφία μυϊκών ινών δεν παρατηρήθηκε, ενώ σε χρώση Αιμοτοξυλίνης - Εωσίνης οι δεσμίδες των γραμμωτών μυϊκών ινών ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων για τα πειραματόζωα και των τριών ομάδων. Η χρώση με ΑΤΡάση και ενζυματική ανάλυση των μυϊκών ινών έδειξε ότι για τις ίνες τύπου Ι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στην αναλογία μεταξύ των ομάδων Α και Β (p=0.786), ενώ η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική για τις ίνες των πειραματοζώων των ομάδων Α και Γ (p=0.027), αλλά και εκείνων μεταξύ των ομάδων Β και Γ (p=0.034). Όσον αφορά στην αναλογία των ινών τύπου ΙΙΑ διαπιστώθηκε ότι υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραματοζώων των ομάδων Α και Β (p=0.044), που σημαίνει μείωση των ινών ΙΙΑ και εκείνων των ομάδων Α και Γ (p=0.001) που εκφράζει αύξηση της αναλογίας των ινών ΙΙΑ των πειραματοζώων των ομάδων Β και Γ (p<0.001) και αύξηση της αναλογίας των ινών ΙΙΑ. Τέλος, η αναλογία των ινών τύπου ΙΙΒ/X ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στα πειραματόζωα της ομάδας Β σε σύγκριση με εκείνα των ομάδων Α (p=0.05) και Γ (p=0.001), ενώ δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραματοζώων των ομάδων Α και Γ (p=0.651). Από τις βιοχημικές δοκιμασίες που αφορούσαν την ολική γλουταθειόνη και την υπεροξειδική δισμουτάση δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των τριών ομάδων πειραματοζώων (p=0.315) και (p=0.071) αντίστοιχα. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στα πειραματόζωα της ομάδα Β συγκριτικά με εκείνα των ομάδων Α και Γ (p=0.005 και p=0.0098 αντίστοιχα), ενώ μεταξύ των ομάδων Α και Γ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά. Όσον αφορά στην αντιοξειδωτική άμυνα του διαφράγματος, η δραστηριότητα της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης ήταν μεγαλύτερη στα πειραματόζωα των ομάδων Β και Γ σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας Α (p=0.021 και p<0.001 αντίστοιχα), ενώ στατιστικά σημαντική διαφορά δεν υπήρξε στην τιμή της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης μεταξύ των πειραματοζώων των ομάδων Β και Γ (p=0.174). Η τιμή δραστηριότητας της αναγωγάσης της γλουταθειόνης ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στα πειραματόζωα της ομάδα Β συγκριτικά με εκείνα της ομάδας Α (p=0.004), ενώ δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά στις τιμές των πειραματοζώων της ομάδας Γ με αυτές των πειραματοζώων των ομάδων Α και Β (p=0.134 και p=0.123 αντίστοιχα). Η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά στις τιμές της μεταξύ των ομάδων Α και Γ (p=0.233), ενώ βρέθηκε διαφορά ανάμεσα στις τιμές των πειραματοζώων των ομάδων Β, Α και Γ (p=0.029 και 0.033 αντίστοιχα). Τέλος, στατιστικά σημαντική ήταν η διαφορά στο ισοζύγιο προοξειδωτικών αντιοξειδωτικών μεταξύ των πειραματοζώων των ομάδων Α και Β (p=0.006). Η τιμή του ισοζυγίου ήταν μεγαλύτερη για τα πειραματόζωα των ομάδων Β και Γ σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας Α, ενώ για τα πειραματόζωα της ομάδας Γ η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.486). Τέλος, μεταξύ των πειραματοζώων των ομάδων Β και Γ δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.267). Συμπεράσματα: Η χρόνια αύξηση της ΕΠ επιφέρει μεταβολές στις μυϊκές ίνες του διαφράγματος, οι οποίες αναγνωρίζονται μόνο από τις ενζυματικές και βιοχημικές δοκιμασίες του μυϊκού ιστού του. Οι ενζυματικές και βιοχημικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν στα πειραματόζωα της ομάδας της χρόνιας αύξησης ΕΠ ήταν διαφορετικές από εκείνες που παρατηρήθηκαν στα πειραματόζωα της ομάδας φόρτισης με βάρος. Αυτό σημαίνει ότι το διάφραγμα αποτελεί γραμμωτό μυ ο οποίος προσαρμόζεται και συμπεριφέρεται ανάλογα με τις συνθήκες κάτω από τις οποίες λειτουργεί. Έτσι, τα αποτελέσματα της προσαρμογής είναι διαφορετικά στις περιπτώσεις χρόνιας αύξησης της ΕΠ από εκείνα με φόρτιση με βάρος. Με τις επιφυλάξεις που υπάρχουν πάντα από τη μεταφορά των πειραματικών ευρημάτων στην κλινική πράξη μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η χρόνια αύξηση της ΕΠ προκαλεί μεταβολές στη λειτουργία του διαφράγματος μέσω ποικίλων ενζυματικών και βιοχημικών μηχανισμών, με τελικό αποτέλεσμα την προσαρμογή του στις νέες συνθήκες παραγωγής αναπνευστικού έργου.