Ο ρόλος της ενδοκυττάριας κυστιδιακής μετακίνησης στην αντιθρομβωτική δράση των εδνοθηλιακών κυττάρων

Abstract

Thromboregulation is a function of vital importance for maintenance of blood fluidity. CD39 is a key thromboregulatory plasma membrane ecto-enzyme, which is expressed by endothelial cells that line the blood vessel wall. The importance of CD39 is based on its high ADPase hydrolytic activity, since ADP is the most potent platelet activator, leading to thrombosis. CD39 is localized in caveolae, which are specialized plasma membrane invaginations. Caveolae have a special lipid composition in comparison with the rest of the plasma membrane, being enriched in cholesterol and sphingolipids. The basic protein of caveolae is caveolin-1, which, due to its high oligomerization causes thecharacteristic bending of the membrane and the subsequent formation of caveolae. In the present study we examined whether the localization of CD39 in caveolae plays a role in its anti-thrombotic function. Using caveolin-1 gene disrupted mice, which lack caveolae, we show that caveolae are not essential either for the enzymatic activity of CD39 or for its targeting to plasma membrane. However, apart from caveolae, other independent plasma membrane microdomains, called lipid rafts, are also enriched in cholesterol and sphingolipids. In order to test whether CD39 is localized in rafts, we performed sucrose flotation experiments using detergent-based approaches. Our results indicated that CD39 associates, at least in part, with distinct lipid rafts and that cholesterol, which isenriched in rafts, regulates the enzymatic activity of CD39. Interferering with cholesterol levels by using drugs, such as MßCD, that deplete membrane cholesterol results in a strong inhibition of the enzymatic and anti-platelet activity of CD39. The mechanism of regulation of CD39 by cholesterol was investigated further and we provide evidence showing that it is not due to biophysical changes of membrane fluidity but rather to a direct interaction between cholesterol and CD39. We concludetherefore that the localization ofCD39 in such cholesterol-rich domains, like caveolae and rafts, warrants a high hydrolytic activity ofthis enzyme. Given the association of CD39 with rafts and the well-known role of rafts in polarized transport, we tested whether CD39 is transported to the plasma membrane in a polarized manner and dissected the responsible targeting signals. Using polarized Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, we showed that indeed CD39 is preferentially targeted to the apical side of the plasma membrane. Besides an apical signal in the ecto-domain, most likely the glycans, we identified an additional apical sorting signal in the N-terminal transmembrane-cytosolic domain, which functions as an independent sorting domain. The finding of the second signal was unexpected since glycosylation is believed to the apical targeting signal. Apart from the role ofthe N-terminal transmembrane domain in apical targeting of CD39, this domain is also required for CD39 enzymatic activity, since its deletion results in 50 % inhibition of the ADPase hydrolytic activity. On the other hand, deletion of the C-terminal transmembrane domain causes almost complete loss of CD39 activity. We showed that inhibition of CD39 activity by deletion of either transmembrane domain is due to loss of the ability of CD39 to engage into acholesterol-mediated mechanism of activation. Furthermore, we showed that the dramatic reduction of CD39 enzymatic activity upon deletion of the C-terminal transmembrane is caused by insufficientglycosylation of the molecule. Consequently, we conclude that this particular transmembrane domain is responsible for glycosylation of CD39 in a posttranslational manner. This result is unexpected since glycosylation is believed to be co-translational and not influenced by regions outside the consensus glycosylation sequence. Finally, we provide evidence that cholesterol might act as a key regulatory molecule in thrombosis. Apart from the activation of the anti-thrombotic CD39 (NTPDase 1), cholesterol inhibits NTPDase 2. This enzyme belongs to the same family of nucleotidases, but unlike CD39, NTPDase 2 produces ADP instead of hydrolyzing it. The simultaneous counterbalancing regulation of these two enzymes by cholesterol, leads to further reduction of the levels of ADP and probably to subsequent protection against thrombosis.

Η θρομβωρύθμιση, είναι μία λειτουργία ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ομαλής ροής του αίματος. Εξέχουσα θέση στη λειτουργία αυτή κατέχει το ένζυμο CD39 (NTPDase 1) που βρίσκεται στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία επενδύουν το αγγειακό τοίχωμα. Η σημασία του ενζύμου αυτού έγκειται στο γεγονός ότι υδρολύει με μεγάλη αποτελεσματικότητα το ADP που οδηγεί σε θρόμβωση. To CD39 εντοπίζεται σε ειδικές εγκολπώσεις της κυτταροπλασματικήςμεμβράνης, τα λεγόμενα caveolae. Τα caveolae έχουν μια ιδιαίτερη λιπιδιακή σύσταση σε σχέση με την υπόλοιπη μεμβράνη, καθώς είναι εμπλουτισμένα σε χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια. Η κύρια πρωτεΐνη των caveolae είναι η caveolin-1, ο ολιγομερισμός της οποίας είναι υπεύθυνος για την καμπή της μεμβράνης και το συνακόλουθο σχηματισμό των caveolae. Στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε εάν ο εντοπισμός του CD39 στα caveolae παίζει ρόλο στην αντιθρομβωτική του δράση. Η χρήση ιστών από ποντίκια από τα οποία απούσιαζε το γονίδιο της caveolin-1, και κατά συνέπεια και τα caveolae, κατέδειξε ότι η απουσία των οργανιδίων αυτών δεν επηρεάζει την ενζυμική δράση του CD39, ούτε και τη στόχευσή του στη μεμβράνη. Ωστόσο, εκτός από τα caveolae, εμπλουτισμό σε χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια εμφανίζουν και ανεξάρτητες μικροπεριοχές της μεμβράνης οι οποίες ονομάζονται rafts. Για να ελέγξουμε τον πιθανό εντοπισμό του CD39 σε rafts, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες επίπλευσης διαλυτοποιημένων μεμβρανών σε βαθμίδωση σακχαρόζης. Τα πειράματα αυτά κατέδειξαν ότι το CD39 συνδέεται τουλάχιστον εν μέρει με λιπιδιακά rafts και ότι η χοληστερόλη, στην οποία είναι εμπλουτισμένα τα rafts, ελέγχει την υδρολυτική δράση του ενζύμου. Συγκεκριμένα, απομάκρυνση της χοληστερόλης των μεμβρανών με το φάρμακο MßCD, προκάλεσε δραματική δοσοεξαρτώμενη ελάττωση της ενζυμικής και αντιαιμοπεταλιακής δράσης του CD39. Ο μηχανισμός με τον οποίο η χοληστερόλη ρυθμίζει την ενζυμική λειτουργία του CD39 διερευνήθηκε περαιτέρω και αποδείχθηκε ότι δεν οφείλεται σεμεταβολή της μεμβρανικής ρευστότητας, αλλά αντίθετα σε απευθείας αλληλεπίδραση ανάμεσα στη χοληστερόλη και το ένζυμο. Συνεπώς, ο εντοπισμός του CD39 στα caveolae, αλλά και στα rafts, φαίνεται να εξυπηρετεί την ανάγκη του ενζύμου να βρίσκεται σε περιοχές της μεμβράνης πλούσιες σε χοληστερόλη, προκειμένου να εμφανίζει βέλτιστη ενζυμική δραστικότητα. Ο εντοπισμός του CD39 στα rafts και ο γνωστός ρόλος των λιπιδιακών αυτών μικροπεριοχών στην πολωμένη μεταφορά μας οδήγησε στη μελέτη της πιθανής πολωμένης στόχευσης του CD39 και στη διερεύνηση των σημάτων διαλογής του. Με τη χρήση ενός πρότυπου συστήματος πολωμένων κυττάρων, δείξαμε ότι το CD39 όντως εμφανίζει πολωμένη εντόπιση και μάλιστα στην κορυφαία επιφάνεια της μεμβράνης. Επιπλέον, αποκαλύφθηκαν δύο ανεξάρτητα σήματα υπεύθυνα για τηνκορυφαία στόχευση, ένα στην εξωκυττάρια περιοχή του μορίου, κατά πάσα πιθανότητα τα σάκχαρα, και ένα στο αμινοτελικό του άκρο. Η εύρεση μάλιστα του δεύτερου σήματος ήταν απρόσμενη, δεδομένου ότι σήμερα πιστεύεται ότι η γλυκοζυλίωση αποτελεί κυρίαρχο σήμα για στόχευση στην κορυφαία μεμβράνη. Εκτός από το ρόλο της στην κορυφαία εντόπιση του CD39, η αμινοτελικήδίαμεμβρανική περιοχή έχει σημασία στην υδρολυτική δράση του ενζύμου, αφού κατάργησή της οδήγησε σε υποδιπλασιασμό της ενζυμικής ενεργότητας. Από την άλλη, η αφαίρεση του καρβοξυτελικού διαμεμβρανικού τμήματος του μορίου είχε ως αποτέλεσμα τη σχεδόν πλήρη απώλεια της ενεργότητας του ενζύμου. Η χαμηλή ενζυμική ενεργότητα, είτε απουσιάζει το ένα ή το άλλο διαμεμβρανικό τμήμα, αποδείξαμε ότι οφείλεται στην αδυναμία του μορίου να ενεργοποιηθεί από τη χοληστερόλη. Περαιτέρω δείξαμε ότι η δραματική μείωση της ενεργότητας του ενζύμου πουπροκαλείται από την αφαίρεση της καρβοξυτελικής διαμεμβρανικής περιοχής οφείλεται στην ελλιπή γλυκοζυλίωση του μορίου. Συνεπώς, η δίαμεμβρανική αυτή περιοχή εξασφαλίζει την επαρκή γλυκοζυλίωση του CD39 μέσω ενός μεταμεταφραστικού μηχανισμού. Το αποτέλεσμα αυτό είναι απρόσμενο δεδομένου ότι η επικρατούσα άποψη υποστηρίζει ότι η γλυκοζυλίωση είναι μία συν-μεταφραστική διαδικασία που δεν επηρεάζεται από περιοχές εκτός της συναινετικής αλληλουχίαςγλυκοζυλίωσης. Τέλος, αναδείξαμε το ρόλο της χοληστερόλης ως κυρίαρχο ρυθμιστικό μόριοστη διαδικασία της θρομβωρύθμισης. Εκτός από την ενεργοποίηση του αντιθρομβωτικού CD39 (NTPDase 1), επιπλέον η χοληστερόλη αναστέλλει το προθρομβωτικό ένζυμο NTPDase 2, που ανήκει στην ίδια οικογένεια ενζύμων με το CD39, αλλά σε αντίθεση με αυτό παράγει ADP αντί να το υδρολύει. Η ταυτόχρονη αντίρροπη ρύθμιση των δύο ενζύμων από τη χοληστερόλη, οδηγεί σε αθροιστική μείωση των επιπέδων του ADP και πιθανά σε συνεπακόλουθη προστασία από τηθρόμβωση.